FORSCHUNG & TECHNIK

Von der Mikroskopie zur Nanoskopie Photoschaltbare Rhodaminamide für die hochaufgelöste optische 3D-Fernfeld-Mikroskopie Schichtweise lichtmikroskopis...

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Forschung & Technik

Von der Mikroskopie zur Nanoskopie Photoschaltbare Rhodaminamide für die hoch­aufgelöste optische 3D-Fernfeld-Mikroskopie Schichtweise lichtmikroskopische Aufnahmen von Zellen auf der Nanoskala, ohne Dünnschnitte anzufertigen? Ein Team um Stefan Hell und Mariano Bossi vom MaxPlanck-Institut für Biophysikalische Chemie in Göttingen macht es jetzt vor mit einer Methode, die sich optische 3D-FernfeldMikroskopie nennt und mit nanoskaliger Auflösung, gutem Signal-Rausch-Verhältnis und relativ kurzen Aufnahmezeiten aufwarten kann. Erfolgsgeheimnis sind spezielle photoschaltbare Fluoreszenzfarbstoffe, wie die Forscher in der Zeitschrift Angewandte Chemie berichten. Diese Rhodaminamide machen die Aufnahme hochaufgelöster 3DBilder transparenter, fluoreszenzmarkierter Objekte, etwa Zellen, möglich. Bis vor nicht allzu langer Zeit galt die Auflösung des Lichtmikroskops als begrenzt durch die Wellenlänge des Lichts. Das bedeutet, dass sich Details, die feiner als 200 Nanometer sind, nicht mehr abbilden lassen. Es gibt dafür zwar nicht-optische Methoden, etwa die Elektronenmikroskopie, aber die Lichtmikroskopie ist noch immer die einzige Methode, um intakte oder sogar lebende Zellen im Innern zu betrachten. Mithilfe von Fluoreszenzfarbstoffen gelingt es, einzelne Zellbestandteile wie Proteine selektiv abzubilden. Heute gilt das Wellenlängen-Dogma als überwunden. Für das erste Konzept, das die Wellenlängenbarriere durchbrach, erhielt Hell 2006 den Deutschen Zukunftspreis. Bei dieser „STEDMikroskopie“ (Stimulated Emission Depletion) werden Moleküle von einem „dunklen“ (nicht-fluoreszenten) Grundzustand in einen „hellen“ (fluoreszenten) angeregten Energiezustand gebracht, mit einer räumlichen Schärfe weit unterhalb 200 nm. Nun demonstriert das Göttinger Team die Leistungsfähigkeit eines weiteren Konzepts. Dazu verwendet man Moleküle, die zwischen „fluoreszent“ und „nichtfluoreszent“ nicht nur überführt, sondern „geschaltet“ werden können. Im Gegensatz zur STEDMikroskopie und verwandten Konzepten des Göttinger Teams werden hier nur vereinzelte, isolierte Markermoleküle nach dem Zufallsprinzip gleichzeitig angeschaltet. Ihre Fluoreszenz wird ausgelesen, anschließend gehen sie automatisch wieder aus. So sind gleichzeitig fluoreszierende (angeschaltete) Marker weiter voneinander entfernt als die minimale Distanz, die vom Mikroskop noch aufgelöst werden kann. Das geht nur mit schaltbaren Molekülen, die in ihrem „eingeschalteten“ Zustand viele Photonen

hintereinander aussenden. Registriert man diese Photonen mit einer Kamera, lässt sich das Zentrum der einzelnen fluoreszierenden Pünktchen ermitteln. Nach der Aufnahme wird das Molekül wieder dunkel, so dass nun weitere, benachbarte Moleküle angeknipst und aufgenommen werden können. Dieser Vorgang wird vielfach wiederholt, bis aus den vielen Pünktchen ein Bild entsteht. So lässt sich die Verteilung rekonstruieren – mit einer Auflösung, die nicht von der Licht-Wellenlänge begrenzt wird. Nun haben die Forscher auch eine Substanzklasse gefunden, die alle Anforderungen dieses Konzepts erfüllt: Rhodaminamide. Herzstück der Moleküle ist ein System aus fünf Ringen. In dieser Form ist die Verbindung farblos und fluoresziert nicht. Lichteinstrahlung erzeugt eine Isomerisierung, bei der einer der Ringe geöffnet wird. In dieser Form ist das Molekül rot und kann mehrfach hintereinander angeregt werden.

Der Clou ist nun: Rhodaminamide lassen sich entweder durch ein UV-Photon anknipsen oder durch zwei Photonen im roten Bereich. Diese 2-Photonen-Anregung kann auf eine dünne Ebene fokussiert werden. Eine biologische Probe lässt sich so Ebene für Ebene aufnehmen und die einzelnen Aufnahmen zu einem Schichtbild rekonstruieren, wobei in der Fokalebene Auflösungen weit unterhalb der Beugungsgrenze (10–30 nm) erreicht werden. Stefan W. Hell Max-Planck-Institut für Biophysikalische Chemie Göttingen www.mpibpc.gwdg.de/abteilungen/200/

Angewandte Chemie 2007, 119, No. 33, 6382-6386

Aufnahme von 5 µm Silizium Kugeln, die mit dem Rhodaminamid 5-NHSS gefärbt und mit dem 2-Photonenver­fahren schichtweise belichtet wurden. A) 3D-Rekonstruktion von 17 Schichten in z-Richtung. B) Aufnahme der Äquatorial­ebene, in A mit Pfeil markiert. Zur Verein­fachung der Darstellung wurde nur ein kleinerer Bereich zur 3D-Rekonstruktion genutzt (quadratische Markierung in B). C, D) Abbildung des ­Lamin-proteins einer U373MG Zelle, gefärbt mit 5-NHSS. C) 3D-Rekonstruktion von 10 Schichten in z-Richtung. D) Äquatorialschnitt (Pfeil in C).

22  Optik & Photonik  Oktober 2007  Nr. 3

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Nano-Pyramiden: (Un)ruhestätten für Licht KIT-Wissenschaftler entwickeln neue optische Resonatoren Die Ägyptischen Pyramiden sollten die toten Pharaonen sicher umschließen und ihnen so den Übergang in einen neuen Zustand ermöglichen. Am Karlsruher Institut für Technologie (KIT) haben die Arbeitsgruppen von Dr. Michael Hetterich und Professor Heinz Kalt jetzt einige nur hundert Nanometer (1 nm = 1 Millionstel Millimeter) hohe Pyramiden entwickelt, in denen eingestrahltes Laserlicht mit so genannten Quantenpunkten in Wechselwirkung tritt. Durch die Energie des Laserlichts angeregt, geben die Quantenpunkte Licht in einem bestimmten Wellenlängenbereich ab. In der Pyramide, die aus der HalbleiterVerbindung Galliumarsenid besteht, wird dieses „neue“ Licht „eingesperrt“ und erst nach einiger Zeit wieder abgestrahlt. Die Pyramide selbst steht auf einem besonderen Spiegel. Zusammen mit den vier Pyramidenflächen reflektiert er das Licht, so dass es im Inneren der Struktur eingeschlossen ist. Bestimmte Lichtwellen überlagern und verstärken sich dabei – ein Phänomen, das als Resonanz bezeichnet wird. Bauelemente, die darauf beruhende quantenoptische Effekte ausnutzen, könnten in Zukunft vielleicht dazu dienen, Licht zu manipulieren. Sie wären damit die technologische Basis für neuartige Quantencomputer, die in einigen Bereichen deutlich schneller und effizienter als heutige Rechner arbeiten würden (Appl. Phys. Lett. 90, 161104 (2007). Um die Pyramiden herzustellen, kombinieren die Forscher am Centrum für Funktionelle Nanostrukturen (CFN) des KIT zwei Verfahren. Mittels der Molekularstrahl-Epitaxie tragen sie einzelne Materialschichten auf, die nur einige hundert Atomdurchmesser dick sind. Anschließend tauchen sie die Probe in eine Lösung aus Phosphorsäure, Wasserstoffperoxid und Wasser, das die einzelnen Schichten unterschiedlich stark wegätzt. Dabei bestimmt das Mischungsverhältnis der Zutaten die Neigung der Pyramidenseiten. Entscheidend für die eigentliche Funktion der Strukturen ist aber ihr Innenleben: In die Pyramiden werden Quantenpunkte mit eingebaut, die aus wenigen Tausend Atomen eines anderen Materials bestehen und den gleichmäßigen Aufbau des Galliumarsenid gezielt stören. Wenn sie mit Laserlicht angeregt werden, strahlen sie selbst wieder Licht mit einer anderen Wellenlänge ab. Der optische Re-

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Nano-Pyramide, Quelle: ­ www.cfn.uni-karlsruhe.de

sonator verstärkt die Licht-Materie-Wechselwirkung und erhöht somit die Ausbeute an abgestrahltem Licht mit bestimmten Wellenlängen. Noch sind andere optische Resonatoren den Karlsruher Nano-Pyramiden in einigen Punkten überlegen. „Aufgrund des neuen Herstellungsverfahrens können wir aber ihre Geometrie und ihren Aufbau gezielter variieren. Damit lassen sich ihre Eigenschaften im Vergleich zu bisher bekannten Strukturen besser kontrollieren“, erläutert der Physiker Matthias Karl, Mitarbeiter in der Arbeitsgruppe von Professor Kalt. Viel versprechend sei zudem die Möglichkeit, Pyramiden in Gruppen zusammenzuschließen und somit gekoppelte Strukturen zu schaffen, die im Hinblick auf Quanten-informationsverarbeitung besonders interessant sind. Dieses Potenzial sah wohl auch die angesehene Fachzeitschrift Nature Photonics, die in ihrer Juni-Ausgabe die Arbeit aus Karlsruhe in ihrer Rubrik „News & Views“ vorstellte. Das Centrum für Funktionelle Nanostrukturen (CFN) wird Teil des KIT Zentrums NanoMikro sein, dessen Gründung bis zum 1.1.2008 geplant ist. DFG-Centrum für Funktionelle Nanostrukturen (CFN)

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Hochempfindliches Verfahren zur Massenanalyse von Biomolekülen Berliner Unternehmen vermarktet in Göttingen entwickelte Technologie Ein Infrarot-Laser trifft einen Mikroflüssigkeitsstrahl und setzt Biomoleküle direkt aus Wasser frei für eine Massenanalyse.

Der technische Aufbau der Flüssigstrahldesorptions-Quelle (ohne Laser) vor einem Hochleistungs-Massenspektrometer.

Ein neues Verfahren für die Massenanalyse von Biomolekülen, die mit einem Laserimpuls direkt aus Wasser freigesetzt werden, hat ein Team von Forschern der Universität ­Göttingen unter der Leitung von Prof. Dr. Bernd Abel entwickelt. Dabei handelt es sich um die Flüssigstrahl-Laserdesorptions-Massenspektrometrie, bei der Laser und Mikroflüssigkeitsstrahlen mit Hochleistungs-Massenspektrometern gekoppelt werden. Aus der Grundlagenforschung am Institut für Physikalische Chemie soll die hochempfindliche und schonende Analysetechnik nun Eingang finden in die industrielle Anwendung auf dem Gebiet der Biotechnologie: Zwei Schlüsselpatente werden nun an die Knauer GmbH auslizensiert. Das Berliner Unterneh-

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men wird spezielle Produktlinien insbesondere für den Einsatz in der Qualitätssicherung und der Bioanalytik fertigen, vertreiben und vermarkten. Realisiert wurde die Göttinger Technologie in Zusammenarbeit mit Wissenschaftlern mehrerer Max-Planck-Institute. In mehrjährigen Forschungsarbeiten konnte das zunächst sehr aufwendige Analyseverfahren vereinfacht und seine Empfindlichkeit um mehrere Größenordnungen soweit gesteigert werden, dass jetzt eine kommerzielle Nutzung möglich ist. Kooperationspartner in der Entwicklung der Technologie sind Kollegen des Max-Planck-Instituts für biophysikalische Chemie und des MPI für Dynamik und Selbstorganisation in Göttingen sowie Wissenschaftler des MPI für Dynamik komplexer

technischer Systeme in Magdeburg. Mit Hilfe der MBM Science Bridge GmbH und der Max-Planck-Innovation GmbH haben die Forscher ihre Arbeitsergebnisse in einer Reihe von Patenten geschützt. Patentinhaber sind die Universität Göttingen und die MaxPlanck-Gesellschaft. Die Auslizensierung an die Knauer GmbH wurde durch die Abteilungen für Technologietransfer der Georgia Augusta und der beteiligten Max-Planck-Institute unterstützt. Für die Fertigung der ausgewählten Produktlinien in Berlin, in denen Hochdruckflüssigchromatographie und Massenspektrometrie kombiniert sind, wird die Göttinger Firma Microliquids GmbH technische Komponenten zuliefern. Derzeit arbeiten die Forscher in Kooperation mit zwei deutschen Laserfirmen an der Entwicklung eines speziellen Infrarot-Lasermoduls, das für weitere kommerzielle Anwendungen der FlüssigstrahlLaserdesorptions-Massenspektrometrie gedacht ist. Einsatzmöglichkeiten der neuen Technologie sieht Prof. Abel unter anderem in der Massenanalyse von großen Biomolekülkomplexen und in den Bereichen Proteomik und Metabolomik, in denen möglichst viele Proteine sowie die charakteristischen Stoffwechsel-Eigenschaften von Zellen analysiert werden müssen. Prof. Dr. Bernd Abel, Universität Göttingen, Institut für Physikalische Chemie www.uni-pc.gwdg.de/troe/b_abel/b_abel.htm

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24 Optik & Photonik Oktober 2007  Nr. 3

Publication dates: Volumes 1 and 2: 2005 Volume 3: December 2006 Volume 4: September 2007 Volume 5: January 2008 Volume 6: October 2008

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