Epidémiologie de la leptospirose aux Antilles françaises

Epidémiologie de la leptospirose aux Antilles françaises : apports du diagnostic par biologie moléculaire dans l’étude des facteurs de risques, des facteurs pronostiques et de l’incidence Patrick Hochedez

To cite this version: Patrick Hochedez. Epidémiologie de la leptospirose aux Antilles françaises : apports du diagnostic par biologie moléculaire dans l’étude des facteurs de risques, des facteurs pronostiques et de l’incidence. Santé publique et épidémiologie. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2015. Français. .

HAL Id: tel-01176154 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01176154 Submitted on 15 Jul 2015

HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of scientific research documents, whether they are published or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.

L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.

THÈSE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE Spécialité : Épidémiologie

Ecole doctorale Pierre Louis de Santé Publique à Paris ED 393 Epidémiologie et Sciences de l’Information Biomédicale Equipe d’accueil : UMR-S 1136 Equipe Epidémiologie clinique de l'infection à VIH stratégies thérapeutiques et comorbidités

Epidémiologie de la leptospirose aux Antilles françaises : apports du diagnostic par biologie moléculaire dans l’étude des facteurs de risques, des facteurs pronostiques et de l’incidence Par Patrick Hochedez Dirigée par le Pr Eric Caumes et le Pr Raymond Césaire Présentée et soutenue publiquement le 13 Janvier 2015 Devant un jury composé de : Pr Eric Caumes, Directeur de thèse Pr Raymond Césaire, Directeur de thèse Pr Jean Louis Herrmann, Rapporteur Pr Jérôme Salomon, Rapporteur Dr Karine Lacombe, Examinateur Dr Paul-Henri Consigny, Examinateur

2

RESUME La leptospirose est la zoonose bactérienne la plus répandue dans le monde et son incidence est plus forte dans les régions tropicales où les conditions de la transmission sont particulièrement favorables. Les animaux domestiques et sauvages, en particulier le rat, constituent le réservoir animal de la maladie et la contamination peut survenir dans des situations diverses comme les travaux agricoles, la pratique de sport aquatiques, ou la vie quotidienne dans les bidonvilles où la maladie représente un problème de santé publique émergent selon l’OMS. On estime qu’il y aurait chaque année plus de 500 000 cas dans le monde avec un taux de mortalité pouvant excéder 10% dans certaines régions. Il apparaît fondamental de disposer de moyens diagnostics de certitude à la phase aigüe de la maladie, car le traitement antibiotique a plus de chance d’être efficace lorsqu’il est prescrit précocement et la prise en charge des défaillances viscérales, comme l’atteinte rénale ou pulmonaire, nécessitent une prise en charge spécifique en service de réanimation. Dans ce travail, nous avons utilisé le diagnostic par biologie moléculaire (RT-PCR) pour contribuer à mieux connaitre l’épidémiologie de la leptospirose aux Antilles. Dans les deux premiers articles, nous rapportons pour la première fois aux Antilles la survenue de cas groupés de leptospirose après des événements sportifs (course à pied, canyoning), s’étant déroulés en forêt tropicale après des périodes de pluies inhabituelles. La présence d’abrasions cutanées a été identifiée comme facteur de risque de l’infection et ces travaux nous ont permis de mettre en avant l’intérêt d’une confirmation diagnostique précoce pour informer rapidement les personnes exposées, débuter le traitement antibiotique en phase aigüe, et diffuser des informations de prévention auprès des pratiquants de ces activités dont la popularité est croissante. Dans le troisième article, nous rapportons grâce à une étude de cohorte prospective portant sur 102 patients diagnostiqués par PCR en temps réel, l’association entre l’élévation de la concentration sanguine de leptospires mesurée à l’admission et la sévérité de la maladie aux Antilles. Un seuil critique de 6.5 log10 (leptospires/ml) pouvait être considéré pour les cas sévères. Les Principaux éléments cliniques relevés à l’admission et associés à la sévérité, pouvant être utilisé pour mieux orienter la prise en charge des patients étaient : l’hypotension, les anomalies auscultatoires, l’ictère et l’anurie. L’identification de l’espèce Leptospira interrogans, le sérovar Icterohaemorrhagiae /Copenhageni, et la présence de rats à domicile était associée à la sévérité. En conclusion, l’utilisation du diagnostic par biologie moléculaire nous a permis de contribuer à l’étude de facteurs de risque et des facteurs pronostiques, mais aussi à mieux connaître le poids réel de la maladie aux Antilles. Mots clés : leptospirose, PCR en temps réel, leptospirémie, Martinique, Leptospira interrogans, sérovar Icterohaemorrhagiae

3

SUMMARY Leptospirosis is a bacterial zoonosis of worldwide distribution whose incidence is higher in in tropical areas where its transmission is easier. Domestic and wild animals, especially rats, are the maintenance hosts and human contamination occur in different setting, such as agricultural work, water-sports practice, or daily activities in slum where it is an emerging health issue according to WHO. It is estimated that more than 500 000 cases occur each year, with fatality rates up to 10% in some areas. Availability of rapid diagnostic tools during acute phase of the disease is top-priority, since antibiotic is more efficient when given early, and leptospirosis-related organ failure, like kidney or lung failure, require specific treatment in intensive care unit. In this work, we rely on molecular diagnosis (RT-PCR) to contribute to the study of leptospirosis epidemiology in the Caribbean. In the first two papers, we describe for the first time in the Caribbean outbreaks of leptospirosis after sporting events in the tropical forest of Martinique (trail running, canyoning) after unusually heavy seasonal rainfalls. The occurrence of cutaneous abrasions was identified as a risk factor for infection and data from those outbreaks suggest that rapid diagnostic assays such as PCR are particularly appropriate in this setting for early diagnosis, information of exposed participants, treatment during acute phase of the disease and epidemiological investigation. In the third paper, we report for the first time in the Caribbean, using a cohort study of 102 patients with PCR-confirmed leptospirosis, that leptospiremia at the time of admission was associated with severity of the disease. A critical threshold of 6.5 log10 (leptospires/ml) could be considered for severe cases. The main clinical findings at the time of admission that were associated with severe leptospirosis and that could be used to identify at risk patients included: hypotension, chest auscultation abnormalities, icterus, and oligoanuria. Identification of Leptospira interrogans species, serovar Icterohaemorrhagiae/Copenhageni, and the presence of rats in the house or in the surrounding vicinity were associated with severity. To conclude, detection methods using RT-PCR allowed us to contribute to the study of risk and prognostic factors, but also to have a better understanding of leptospirosis public health impact in the Caribbean. Keywords: leptospirosis, RT-PCR, leptospiremia, Martinique, Leptospira interrogans, serovar Icterohaemorrhagiae

4

REMERCIEMENTS Je voudrais sincèrement remercier :

Le Pr Eric Caumes, codirecteur de cette thèse à Paris Pour ses conseils, sa disponibilité et son soutien pendant ce travail et toutes ces années depuis mon passage comme interne à la Pitié-Salpêtrière. धन्यवाद dhanyabad (merci népali)

Le Pr Raymond Césaire, codirecteur de cette thèse à Fort de France Pour ses conseils, sa disponibilité et son soutien pendant ce travail de thèse en Martinique.

Le Pr Jérôme Salomon, Rapporteur Pour avoir accepté de rapporté ce travail et pour sa disponibilité et ses encouragements depuis mon clinicat à l’hôpital Raymond Poincaré de Garches.

Pr Jean Louis Herrmann, Rapporteur Pour avoir accepté de rapporté ce travail et pour sa disponibilité. Le Dr Karine Lacombe, examinateur Pour avoir accepté d’être membre de mon jury et pour sa disponibilité. Le Dr Paul-Henri Consigny, examinateur Pour avoir accepté d’être membre de mon jury et pour sa disponibilité.

Le Dr Claude Olive, chef du service de bactériologie du CHU de Martinique Pour m’avoir si bien accueilli dans son laboratoire, pour avoir partagé sa passion de la microbiologie est ses connaissances, pour ses conseils précieux. 5

Le Dr Rafaelle Théodose, bactériologiste au CHU de Martinique Pour sa disponibilité et ses conseils précieux tout au long de ce travail.

A Mme Dorothée Haug et toute l’équipe du laboratoire de Bactériologie du CHUM Pour leur travail minutieux, leur gentillesse et leur aide dans la réalisation de cette thèse.

Le Dr Mathieu Picardeau, directeur du CNR de la leptospirose à l’Institut Pasteur Pour sa disponibilité, ses conseils précieux et pour avoir partagé ses connaissances sur le vaste monde des leptospires.

Le Dr Pascale Bourhy, CNR de la leptospirose à l’Institut Pasteur Pour sa disponibilité, ses conseils et ses encouragements tout au long de ce travail.

Le Pr André Cabié, chef du service de Maladies Infectieuses du CHUM Pour m’avoir accueilli dans son équipe, pour son soutien et son aide méthodologique, pour avoir partagé ses connaissances sur la recherche clinique.

A M Jacques Rosine, épidémiologiste Pour son soutien, ses encouragements et son aide dans les enquêtes épidémiologiques.

Au Dr Hossein Mehdaoui, au Dr Ruddy Valentino et l’équipe de réanimation du CHUM Pour leur disponibilité, et pour avoir partagé leurs connaissances sur la prise en charge des leptospiroses sévères

Aux co-auteurs des articles inclus dans cette thèse

6

Pour leur contribution à ces articles et tout le travail fait ensemble.

Au Dr Fatiha Najioullah et toute l’équipe de virologie Pour leur accueil et leur disponibilité.

A M. Janick Jean-Marie et toute l’équipe du Centre d’Investigation Clinique et d’Epidémiologie Clinique (CIC-EC) Antilles-Guyane Pour leur aide sans faille lors de la mise en place des protocoles de recherche clinique et pour leur soutien méthodologique.

Le Dr Sylvie Merle et l’équipe de Direction de la Recherche Clinique et de l’Innovation (DRCI) du CHU de Martinique Pour leur aide méthodologique lors de la rédaction des protocoles de recherche clinique.

Le Ministère de la Santé avec la participation du Groupement Interrégional de Recherche Clinique et d'Innovation Sud-Ouest Outre-Mer (PHRCI 2011) Pour le financement de la recherche.

Mes collègues du service du service des Maladies Infectieuses et Tropicales de Fort de France Pour m’avoir accueilli dans leur équipe, pour leur soutien et leur amitié.

Je voudrais adresser mes remerciements sincères aux patients qui ont acceptés de participer à la recherche clinique.

Je voudrais dédier cette thèse à ma famille qui m’a toujours soutenu et encouragé malgré l’éloignement.

7

TABLE DES MATIERES RESUME.................................................................................................................................... 3 SUMMARY ............................................................................................................................... 4 REMERCIEMENTS .................................................................................................................. 5 TABLE DES MATIERES ......................................................................................................... 8 ABREVIATIONS .................................................................................................................... 10 LISTE DES FIGURES ............................................................................................................. 11 LISTE DES TABLEAUX ........................................................................................................ 12 LISTE DES PUBLICATIONS................................................................................................. 13 INTRODUCTION .................................................................................................................... 14 1. ETAT DE L’ART............................................................................................................. 18 1.1 Agent causal .............................................................................................................. 18 1.1.1 Microbiologie .......................................................................................................... 18 1.1.2 Taxonomie............................................................................................................... 20 1.2 Epidémiologie ................................................................................................................ 22 1.2.1 Cycle de la leptospirose et transmission à l’homme ............................................... 22 1.2.2 Une maladie tropicale répandue mais négligée ....................................................... 24 1.3 Physiopathologie ............................................................................................................ 30 1.3.1 Inoculum.................................................................................................................. 30 1.3.2 Facteurs de virulence bactériens ............................................................................. 30 1.3.3 Facteurs liés à l’hôte ................................................................................................ 31 1.3.4 Principales lésions tissulaires au cours de la leptospirose....................................... 32 1.4 Manifestations cliniques ................................................................................................. 36 1.4.1 Forme anictérique pseudo-grippale ......................................................................... 36 1.4.2 Complications viscérales ......................................................................................... 37 1.4.3 Facteurs pronostiques de décès au cours de la leptospirose .................................... 41 1.4.4 Diagnostic différentiel ............................................................................................. 42 1.5 Diagnostic biologique .................................................................................................... 43 1.5.1 Les tests biologiques usuels .................................................................................... 43 1.5.2 Cinétique des leptospires et des anticorps dans le sang .......................................... 43 1.5.3 Diagnostic bactériologique direct : mise en évidence des leptospires ou de leur ADN ................................................................................................................................. 44 1.5.4 Diagnostic sérologique ............................................................................................ 50 1.5.5 Identification ........................................................................................................... 51 1.5.6 Conclusions du rapport d’évaluation de la HAS sur le diagnostic biologique de la leptospirose, 2011............................................................................................................. 52 1.6 Traitement ...................................................................................................................... 54 1.6.1 Le traitement antibiotique ....................................................................................... 54 1.6.2 Le traitement des défaillances viscérales ................................................................ 56 1.7 Prévention....................................................................................................................... 57 1.7.1 Vaccination.............................................................................................................. 57 1.7.2 Prophylaxie médicamenteuse .................................................................................. 58 8

2. 3.

OBJECTIFS DE LA THESE ........................................................................................... 59 RESULTATS ................................................................................................................... 60 3.1. Article 1 - Outbreak of Leptospirosis after a Race in the Tropical Forest of Martinique .............................................................................................................................................. 60 3.2. Article 2 - Outbreak of leptospirosis among canyoning participants, Martinique, 2011 .............................................................................................................................................. 67 3.3. Article 3 – Severe leptospirosis is associated with high levels of leptospiremia and Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae in Martinique ................................ 76 4. SYNTHESE ET DISCUSSION ........................................................................................... 97 4.1 Apports du diagnostic par biologie moléculaire dans l’étude des facteurs de risques ... 97 4.2 Apports du diagnostic par biologie moléculaire dans l’étude des facteurs pronostiques .............................................................................................................................................. 99 4.3 Apports du diagnostic par biologie moléculaire dans l’étude de l’incidence .............. 101 5. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ............................................................................. 103 6. ARTICLES ET POSTERS ECRITS PENDANT LA THESE .......................................... 106 6.1 Publications liées au travail de thèse sur la leptospirose .............................................. 106 6.1.1 Articles .................................................................................................................. 106 6.1.2 Posters présentés en congrès ................................................................................. 106 6.1.3 Rapport d’évaluation technologique. Diagnostic biologique de la leptospirose ... 107 6.1.4 Etude sur l’incidence de la leptospirose aux Antilles ........................................... 107 6.1.5 Chapitres de livres ................................................................................................. 107 6.2 Publications non liées au travail de thèse ..................................................................... 107 7. BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................. 108 8. ANNEXES ......................................................................................................................... 116 8.1 Résumé du Protocole de Recherche Clinique LEPTO ................................................. 116 8.2 Illustration des sites de trail et de canyoning ............................................................... 122 8.3 Fiches d’informations destinées aux pratiquants des sports à risque de leptospirose (recto/vero) ......................................................................................................................... 123 8. 4 Résumé du Protocole de Recherche Clinique Ciné LEPTO ....................................... 125

9

ABREVIATIONS

ARS

Agence Régionale de Santé

CIRE

Cellule de l'Institut de veille sanitaire en Région

EDTA

Ethylène-Diamine Tétra-Acétique

ELISA

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

CNRL

Centre National de Référence de le Leptospirose

HAS

Haute Autorité de Santé

HLA

Human Leukocyte Antigen

LERG

Leptospirosis burden Epidemiology Reference Group

MAT

Micro-Agglutination Test

MLST

Multi Locus Sequence Typing

MLVA

Multiple Loci Variable Number of Tandem Repeats Analysis

OMS

Organisation Mondiale de la Santé

PCR

Polymerase Chain Reaction

qPCR

PCR quantitative

RT-PCR

Real Time PCR, PCR en temps réel

SPHS

Severe Pulmonary Hemorrhage Syndrome

Tm

Melting temperature, température de fusion

WHO

World Health Organisation

VNTR

Variable Number of Tandem Repeats

10

LISTE DES FIGURES Figure 1 - Situation géographique de la Martinique. ............................................................... 16 Figure 2 - Carte pluviométrique de la Martinique, 2009 (Météo France) ................................ 16 Figure 3 - Vue en microscope à fond noir (A) et en microscope électronique (B, C) de leptospires (Bourhy 2012). ....................................................................................................... 19 Figure 4 - Arbre phylogénétique des espèces du genre Leptospira (L.) .................................. 21 Figure 5 - Représentation schématique du cycle de la leptospirose (Bourhy 2012). ............... 23 Figure 6 - Rongeurs présents en Martinique. ........................................................................... 24 Figure 7 - Répartition des principaux sérogroupes identifiés par MAT en 2013. .................... 26 Figure 8 - Répartition dans l’année des cas de leptospirose en Métropole. ............................. 26 Figure 9 - Nombre de cas de leptospirose en France métropolitaine et en outre-mer par année (Picardeau 2013). ..................................................................................................................... 29 Figure 10 - Atteinte rénale dans un modère animal. ................................................................ 33 Figure 11 - Atteinte hépatique dans un modèle animal. ........................................................... 34 Figure 12 - Atteinte pulmonaire dans un modèle animal. ........................................................ 35 Figure 13 - Radiographie thoracique d’un patient présentant une hémorragie intra-alvéolaire au cours d’une leptospirose sévère. .......................................................................................... 39 Figure 14- Evolution schématique de la leptospirémie et des anticorps au cours de la leptospirose (Picardeau 2013). ................................................................................................. 44 Figure 15 - Cinétique de la leptospirose au cours de l’infection. ............................................. 47 Figure 16 - Détection des leptospires à partir de prélèvements sanguins par culture ou amplification génique. .............................................................................................................. 48 Figure 17 - Courbes de fusion .................................................................................................. 49

11

LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 - caractéristiques des 21 espèces de leptospires aujourd’hui décrites. D’après rapport CNRL 2012 (Picardeau 2012). .................................................................................... 21 Tableau 2 - Réservoir animal habituel des sérovars les plus communs (Bharti 2003). ........... 24 Tableau 3 - Répartition des cas dans les régions d’Outre-Mer en 2013 (Picardeau 2013). ..... 29

12

LISTE DES PUBLICATIONS Liste des publications réalisées dans le cadre du travail de thèse : -

Outbreak of leptospirosis after a race in the tropical forest of Martinique. Hochedez P, Rosine J, Théodose R, Abel S, Bourhy P, Picardeau M, Quénel P, Cabié A. Am J Trop Med Hyg. 2011 Apr;84(4):621-6.

-

Outbreak

of

leptospirosis

among

canyoning

participants,

Martinique,

2011. Hochedez P, Escher M, Decoussy H, Pasgrimaud L, Martinez R, Rosine J, Théodose R, Bourhy P, Picardeau M, Olive C, Ledrans M, Cabie A. Euro Surveill. 2013 May 2;18(18):20472.

Manuscrit soumis au journal Emerging Infectious Diseases (soumis le 28/06/2014) : -

Severe leptospirosis is associated with high levels of leptospiremia and Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae in Martinique. Patrick Hochedez, Rafaelle Theodose, Claude Olive, Pascale Bourhy, Guillaume Hurtrel, Nicolas Vignier, Hossein Mehdaoui, Ruddy Valentino, Roland Martinez, Jean-Marie Delord, , Cécile Herrmann, Isabelle Lamaury, Raymond Césaire, Mathieu Picardeau, André Cabié.

13

INTRODUCTION La leptospirose est une zoonose bactérienne de répartition mondiale avec une incidence plus forte dans les régions tropicales où les conditions de la transmission sont particulièrement favorables, particulièrement pendant les périodes de fortes pluviosités. L’épidémiologie de la leptospirose s’est modifiée et si la maladie représente toujours un problème de santé publique majeur en zone rurale, c’est aujourd’hui une pathologie émergente dans les bidonvilles des régions tropicales du fait de l’urbanisation non contrôlée, la surpopulation, les mauvaises conditions d’hygiène et la pullulation des rats qui constituent son principal réservoir animal (Faine 1999; Levett 2001; Bharti 2003). L’homme est un hôte accidentel dans un cycle impliquant les animaux domestique et sauvages, qui contaminent l’environnement par leurs urines. On distingue habituellement les régions tempérées où l’incidence varie de 0,1 à 1 /100 000 et les régions tropicales où l’incidence est supérieure à 10/100 000 (Ricaldi 2013). Cependant, cette incidence est sous-estimée du fait de sa présentation initiale souvent non spécifique, de l’absence de moyen diagnostic fiable et de l’absence de système de surveillance dans de nombreux pays d’endémies. Les formes sévères de la maladie sont encore associées à une mortalité élevée, liée à plusieurs facteurs comme les difficultés diagnostiques, le retard thérapeutique, l’absence d’infrastructure pour la prise en charge des cas sévères, et d’autres facteurs moins connus comme la virulence de certaines souches ou la susceptibilité de l’hôte. Les atteintes viscérales les plus sévères de la maladie sont l’insuffisance rénale et l’hémorragie pulmonaire, toutes deux nécessitant une prise en charge réanimatoire qui n’est pas disponible dans toutes les zones d’endémie, et sont associées à une mortalité pouvant dépasser 50% (Trevejo 1998; Panaphut 2002; Paganin 2007; Gouveia 2008). La leptospirose demeure un problème majeur de santé publique et la mise à disposition d’outils diagnostics rapides, la prise en charge thérapeutique précoce et la mise en place de mesure de prévention adaptée restent une priorité dans la majorité des régions d’endémie. Au début des années 2000, les premières séquences complètes du génome de Leptospira ont été rapportées en Chine et au Brésil, deux pays où la maladie a un poids important et ces travaux sont prometteurs pour avancer dans la compréhension de la pathologie (Ren 2003; Nascimento 2004). Cependant, si des progrès majeurs ont été accomplis dans la compréhension de la biologie et de la pathogénèse de la maladie, nous ne disposons pas 14

encore d’un vaccin efficace contre l’ensemble des sérovars circulant et la prévention repose avant tout sur les mesures de protection individuelles ou la lutte contre les rongeurs. Près de 20 espèces et 300 sérovars ont été identifiés, parmi lesquels le sérovar Icterohaemorrhagiae qui est l’un des plus fréquemment responsable d’infections chez l’homme et dont l’animal réservoir est habituellement le rat (Picardeau 2013). L’utilisation de technique de biologie moléculaire comme la PCR en temps réel, permet un diagnostic de certitude à la phase aigüe de la maladie, quand le traitement antibiotique a le plus de chance d’être efficace, et avant que les résultats des sérologies ou de la culture soient disponibles. Par ailleurs, cette même technique permet de déterminer la concentration en leptospires dans le prélèvement utilisé pour le diagnostic. Dans ce contexte, nous avons mis en place une étude de cohorte intitulée « Étude de la valeur pronostique de la leptospirémie quantitative déterminée par PCR en temps réel au cours de la leptospirose aux Antilles » et qui a obtenu le financement du PHRC 2011- Appel à projets Interrégionaux (QS résumé du Protocole de Recherche Clinique LEPTO en ANNEXE 7.1). L’objectif principal de cette étude était de déterminer si la leptospirémie quantitative prélevée au moment du diagnostic précoce était prédictive d’une évolution sévère de la maladie. Les objectifs secondaires étaient de décrire les caractéristiques cliniques et biologiques associées à évolution sévère de la leptospirose. Au cours de l’année 2011 et pendant le déroulement de l’étude précédemment décrite, une étude d’incidence a été réalisée par l’InVS aux Antilles à laquelle nous avons contribué activement (Cassadou 2013). La Martinique est une île de 1 128 km2 (environ 70 km de longueur, pour 30 km de largeur), sa population était estimée par l’INSEE à 398 6864 au premier janvier 2011. Elle située dans les petites Antilles et son climat est tropical humide avec une saisonnalité marquée et un maximum des précipitations lors des 2 derniers trimestres. La partie nord est la plus montagneuse et abrite la forêt tropicale humide et de nombreuses rivières (Figure 1, Figure 2). Les principales ressources économiques de l’île sont l’agriculture, avec notamment l’exportation de bananes et la culture de la canne à sucre (pour la production de sucre et de rhum agicole), et le tourisme.

15

Figure 1 - Situation géographique de la Martinique.

Figure 2 - Carte pluviométrique de la Martinique, 2009 (Météo France) 16

De la pratique clinique émerge plusieurs problématiques de santé publique : quels sont les facteurs de risques de leptospirose, quels sont les facteurs pronostiques de la maladie, et quelle est l’incidence réelle de la leptospirose aux Antilles. Dans ce travail de thèse nous nous sommes focalisés sur l’épidémiologie de la leptospirose en Martinique et, en utilisant le diagnostic par biologie moléculaire, nous avons contribué à répondre à plusieurs questions : -

Quelle est la place des tests diagnostiques comme la PCR en temps réel dans une enquête épidémiologique autour de cas groupés de leptospirose ?

-

Quels facteurs de risque peuvent-ils être identifiés et quelles recommandations de prévention peuvent être données dans ce contexte ?

-

Quels ont les facteurs cliniques et biologiques associés à la sévérité de la maladie ?

-

Quelle sont les tests diagnostiques nécessaires au suivi de l’incidence de la maladie ? Dans cette thèse sont présentés 3 articles : les deux premiers rapportent les résultats des

enquêtes épidémiologiques menées après des événements sportifs marqués par des cas groupés de leptospirose, en discutant en particulier les différents facteurs de risques. Le troisième (manuscrit soumis au journal Emerging Infectious Diseases le 28/06/2014) rapporte les résultats d’une étude de cohorte dont les objectifs étaient de déterminer si l’élévation de la leptospirémie était associée à la sévérité de la maladie et identifier quels critères cliniques et biologiques pouvaient être utilisés comme facteurs pronostics à l’admission. Pour les 2 premiers articles j’ai contribué au travail par la mise en place de l’enquête épidémiologique et l’analyse des résultats en collaboration avec les co-auteurs. Pour le 3eme travail dont j’étais l’investigateur principal, j’ai rédigé le protocole de recherche clinique, inclus et suivi la majorité des patients, analysé les résultats en collaboration avec les co-auteurs. Enfin, j’ai contribué à la valorisation des résultats à travers des articles, des présentations orales et des posters, et la diffusion des conseils de prévention auprès des pratiquants des sports à risques. Comme introduction à la présentation des résultats, le chapitre suivant fait l’état de l’art sur l’agent causal, l’épidémiologie de la leptospirose, la physiopathologie, les principales manifestations cliniques, le diagnostic biologique, la prise en charge thérapeutique et la prévention.

17

1. ETAT DE L’ART 1.1 Agent causal 1.1.1 Microbiologie Le genre Leptospira appartient à l’ordre des Spirochaetales, qui comporte les familles Leptospiraceae, Spirochaetaceae (bactéries des genres Treponema et Borrelia) et Serpulinaceae (bactéries du genre Brachyspira) (Bourhy 2012). Ce regroupement au sein d’un même phylum sur la base de l’ARNr 16S est corrélé à des caractères morphologiques communs et uniques dans le monde bactérien : les spirochètes sont des bactéries spiralées qui possèdent un endoflagelle (flagelle périplasmique). Les leptospires sont des bactéries très mobiles, aérobies, ayant une forme hélicoïdale, une longueur de 6 à 20 µm et un diamètre d’environ 0,1 µm rendant indispensable l’utilisation d’un microscope à fond noir (ou à défaut un microscope à contraste de phase) pour leur observation (Figure 3). Un endoflagelle est ancré dans la membrane interne à chaque extrémité de la cellule et ils se prolongent jusqu’au centre de la cellule sans se chevaucher. La rotation de l’endoflagelle est responsable de la mobilité et de l’apparition de crochets et/ou de spirales aux extrémités, ce qui leur donne leur forme caractéristique en point d’interrogation (Ko 2009). Les premiers séquençages du génome de Leptospira ont été publiés par des équipes chinoises (L. interrogans serovar Lai, agent de la leptospirose rurale, 2003) et brésiliennes (L. interrogans serovar Copenhageni, agent de la leptospirose urbaine épidémique, 2004) qui ont montré combien les génomes étaient hautement conservé entre les 2 sérovars (Ren 2003; Nascimento 2004). Le génome des leptospires est constitué de deux chromosomes circulaires, d’une taille totale d’approximativement 4 mégabases (environ 4,3MB et 350 kb respectivement), et possède un Guanine-Cytosine Content (GC %) qui varie de 35 % à 41 %. Un plasmide et un bactériophage, tous deux réplicons circulaires d’une taille de 74 kb, ont aussi été décrits chez le saprophyte L. biflexa (Saint Girons 1990; Picardeau 2008). Les leptospires sont des bactéries chimio-organotrophes aérobies strictes qui utilisent les acides gras à longue chaîne comme seule source d’énergie et de carbone. L’ion ammonium est la source d’azote, les vitamines B1 et B12 étant des facteurs de croissance nécessaires de même que le fer ferreux. Leur croissance optimale est obtenue à 28-30 ◦C avec un pH de 7,218

7,6 (Bourhy 2012). Les leptospires sont capables de former des biofilms in vitro (Ristow 2008). Ces bactéries sont très sensibles à la dessiccation, aux pH extrêmes, à de faibles concentrations de chlore, aux milieux hypertoniques (environnements salins) et à la chaleur (Faine 1999). Le milieu de culture le plus utilisé est le milieu EMJH mis au point par Ellinghausen-McCullough (1965), puis modifié par Johnson et Harris (1967) (Ellinghausen 1965; Johnson 1967).

Figure 3 - Vue en microscope à fond noir (A) et en microscope électronique (B, C) de leptospires (Bourhy 2012).

19

1.1.2 Taxonomie Le genre Leptospira a été initialement divisé en deux groupes : L. interrogans sensu lato pour désigner les souches pathogènes et L. biflexa sensu lato pour les souches saprophytes et aquicoles (Faine 1999). Vingt et une espèces de leptospires ont été décrites et classées en 3 groupes sur la base de leur phylogénie et de leur pathogénie (Cerqueira 2009). On distingue les espèces saprophytes (souches environnementales non pathogènes), les espèces pathogènes (souches isolées de l’homme ou d’animaux) et les espèces dites intermédiaires qui forment un groupe distinct sur la base de la séquence de l’ARNr 16S et pour lesquelles le caractère virulent n’a pas été démontré expérimentalement (Figure 4, Tableau 1). En 2014, une nouvelle espèce pathogène nommée Leptospira mayottensis, a été identifiée par l’équipe du CNR Leptospirose à L’Institut Pasteur, à partir de prélèvement sanguins de patients pris en charge à Mayotte (Bourhy 2014). Les leptospires sont classés en plus de 300 sérovars regroupés en une trentaine de sérogroupes (sérovars antigéniquement proches) sur la base de la structure du lipopolysaccharide (LPS) (Faine 1999). L’identification du sérovar est complexe et réservée à quelques centres collaborateurs de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS). L’électrophorèse en champ pulsé est une alternative moléculaire permettant d’identifier le sérovar à partir du profil de macrorestriction de l’ADN génomique (Herrmann 1992; Galloway 2010). La classification sérologique n’est pas toujours corrélée à la classification génétique et, du fait d’un transfert horizontal d’une partie du locus rfb codant la synthèse du LPS, les sérovars d’un même sérogroupe peuvent appartenir à différentes espèces (de la PenaMoctezuma 1999). La classification génomique n’a cependant pas remplacé la classification sérologique, cette dernière étant encore largement utilisée dans les études épidémiologiques car les sérovars sont généralement associés à un réservoir animal spécifique. Par exemple les rats et les chiens sont généralement les hôtes respectifs des sérovars Icterohaemorrhagiae et Canicola (Bharti 2003). La nomenclature officielle doit inclure l’espèce, suivi du sérovar, suivi du nom de souche ; par exemple : Leptospira (nom de genre) interrogans (nom d’espèce) sérovar Icterohaemorrhagiae souche Verdun (Levett 2006).

20

Figure 4 - Arbre phylogénétique des espèces du genre Leptospira (L.) Construit à l’aide d’un fragment du gène rrs codant l’ARNr 16S. La barre correspond à deux changements de nucléotides pour 100 nucléotides (Bourhy 2012).

Tableau 1 - caractéristiques des 21 espèces de leptospires aujourd’hui décrites. D’après rapport CNRL 2012 (Picardeau 2012). 21

1.2 Epidémiologie 1.2.1 Cycle de la leptospirose et transmission à l’homme La leptospirose est une zoonose au cours de laquelle l’homme est un hôte accidentel dans un cycle impliquant les animaux sauvages et domestiques. Le cycle est entretenu dans la nature par l’infection chronique des hôtes de maintenance (rongeurs, bétails), dont les tubules rénaux sont colonisés, et qui contaminent leur environnement via leurs urines. La contamination par les leptospires peut être directe, après contact avec l’urine ou les tissus d’animaux infectés, ou plus fréquemment indirecte après contact avec l’environnement contaminé par ces urines (Levett 2001). Les leptospires pénètrent dans l’organisme au niveau de lésions cutanées ou par les muqueuses des yeux, de la bouche ou du nez après contact avec de l’eau contaminée (Figure 5). Les hôtes de maintenance sont le plus souvent asymptomatiques, comme les rongeurs qui représentent le principal réservoir animal de la maladie, et peuvent excréter des leptospires dans leurs urines durant toute leur vie (Faine 1999). Cependant, d’autres animaux comme les chiens peuvent être à l’origine de contamination humaine, mais aussi présenter des manifestations aigues et potentiellement mortelles de la maladie (Rojas 2010). Chez le bétail, la leptospirose est responsable d’avortements et de baisse de productivité avec de lourdes conséquences économiques. L’homme, même s’il peut excréter des leptospires pendant plusieurs semaines, ne semble pas une source effective de transmission. Des leptospires pathogènes ont été identifiés dans les eaux de surface de régions tempérées et tropicales, leur survie est dépendante de plusieurs facteurs dont la température, le pH et la présence d’inhibiteurs (Levett 2001; Ganoza 2006; Vein 2012; Rawlins 2014). La prévalence des différents sérovars dans une population dépend directement du réservoir animal présent et des sérovars dont ils sont porteurs, mais aussi des conditions environnementales, des conditions de vies, de la densité de population, et du degré de contact entre les hôtes de maintenance et l’homme. La diversité des sérovars est ainsi maximale dans les régions tropicales où persiste une grande diversité du réservoir animal, et minimale dans les environnements urbains où les rats et les chiens représentent le principal réservoir animal (Ko 1999; Bharti 2003). Certaines associations hôtes-sérovars semblent ubiquitaires comme les rats et le sérovar Icterohaemorrhagiae, les souris et le sérovar Ballum, le bétail et le sérovar Hardjo, ou encore les chiens et le sérovar Canicola (Levett 2001; Bharti 2003). Cette

22

spécificité relative permet d’extrapoler sur les principaux réservoirs animaux en fonction des résultats des sérologies pratiquées chez l’homme (Tableau 2). Sur les petites îles tropicales, si la grande majorité des mammifères peuvent être infectés et participer à la contamination de l’environnement, le contact avec les rats reste un facteur de risque majeur (Perrocheau 1997; Bovet 1999). Aux Antilles françaises les études vétérinaires ont confirmé la présence de l’infection chez les animaux sauvages (rongeurs, mangouste) comme domestiques (chiens, bovins, caprins, porcs, chevaux) (Desvars 2010). Les trois espèces de rongeurs coexistant aux Antilles françaises (Rattus rartus, Rattus norvegicus, Mus musculus) sont des hôtes de maintenance potentiels de la maladie (Figure 6).

Figure 5 - Représentation schématique du cycle de la leptospirose (Bourhy 2012).

23

Tableau 2 - Réservoir animal habituel des sérovars les plus communs (Bharti 2003).

Figure 6 - Rongeurs présents en Martinique.

1.2.2 Une maladie tropicale répandue mais négligée La leptospirose est la zoonose la plus largement répandue dans le monde mais elle est aussi considérée comme une maladie tropicale négligée, en particulier en Amérique latine et dans la région Caraïbe (Hotez 2008). La chaleur et l’humidité étant des facteurs limitant de la survie des leptospires, la maladie a un caractère saisonnier avec des pics d’incidence pendant l’été et l’automne dans les pays tempérés et pendant la saison des pluies en région tropicale. Selon les estimations de l’OMS il y aurait chaque année plus de 500 000 cas dans le monde avec un taux de mortalité pouvant excéder 10% dans certaines régions (WHO 1999; WHO 2011). Ce nombre est probablement sous-estimé dans de nombreux pays, faute de moyens diagnostics ou de système de surveillance fiable et un groupe de travail international, mis en place par l’OMS, a été chargé d’évaluer l’impact global de la maladie : Leptospirosis burden Epidemiology Reference Group (LERG) (Abela-Ridder 2010).

24

L’incidence de la leptospirose varie de 0.1 à 1/100 000 cas par an dans les pays tempérés à 10 à 100/100 000 cas par an dans les pays tropicaux. Durant les épidémies et dans les groupes les plus exposés, l’incidence peut dépasser 100/100 000 (WHO 2003). Les incidences annuelles les plus élevées sont rapportées dans les Caraïbes, l’Amérique latine, le sous-continent indien, l’Asie du Sud-Est et l’Océanie (Pappas 2008). L’incidence est mal connue en Afrique où les conditions climatiques et environnementales devraient pourtant lui être favorables dans de nombreuses régions (Bourhy 2012; de Vries 2014). Dans les pays industrialisés des zones tempérées, la leptospirose est une maladie qui touche habituellement certaines catégories professionnelles exposées (agriculteurs, éleveurs, personnels des abattoirs, égoutiers, vétérinaires, etc) mais l’importance relative de ces risques occupationnels tend à diminuer avec l’amélioration des mesures de prévention. La leptospirose touche par contre de manière croissante les adeptes de loisirs aquatiques (pêche, canoë-kayak, sports d’eaux vives) et les voyageurs en zone tropicale (Morgan 2002; Sejvar 2003; Bourhy 2012). En France, les données épidémiologiques sont publiées chaque année par le Centre National de Référence (CNRL, Institut Pasteur), principal laboratoire français à pratiquer le diagnostic de la leptospirose humaine et d’un des cinq Centres Collaborateurs de l’Organisation Mondiale de la Santé sur la leptospirose à travers le monde (Picardeau 2013). La France est le pays industrialisé dont le taux d’incidence est le plus élevé et pour la métropole, l’incidence est d’environ 0,5 cas pour 100 000 habitants, soit environ 300 cas notifiés tous les ans (Baranton 2006). En 2013, 385 cas ont été notifiés et l’incidence moyenne était de 0,60 cas/100000 habitants. Comme les années précédentes, l’incidence la plus élevée (3,73 cas/100000 h.) est retrouvée en Franche-Comté (44 cas). Les principaux facteurs de risque identifiés dans une étude cas-témoins réalisée en France métropolitaine en 1999-2000 étaient l’existence de lésions cutanées, la pratique du canoë-kayak, le contact avec des rongeurs sauvages, et un lieu de résidence à la campagne (Nardone 2004). La majorité des cas a été diagnostiquée par la technique de micro-agglutination (MAT). En 2013, le sérogroupe Icterohaemorrhagiae est prédominant comme les années précédentes (Figure 7). Le sérogroupe ne peut être déterminé pour une partie non négligeable des cas positifs à cause de réactions croisées entre plusieurs sérogroupes en MAT. Plus de 50% des cas de leptospirose se répartissent sur la période estivo-automnale, entre les mois d’août à novembre (Figure 8)(Picardeau 2013).

25

Figure 7 - Répartition des principaux sérogroupes identifiés par MAT en 2013. Pour 70 cas séropositifs, le sérogroupe n’a pu être identifié à cause de réactions croisées ou coagglutinations. AUS, Australis ; CAN, Canicola ; GRI, Grippotyphosa ; ICT, Icterohaemorrhagiae; HEB, Hebdomadis; BAL, Ballum; SEJ, Sejroe; PAN, Panama; POM, Pomona; PYR, Pyrogenes; DJA, Djasiman; LOU, Louisiana; SHA, Sharmin; SHER, Shermani; BAT, Bataviae; MIN, Mini; SAR, Sarmin; CYN, Cynopteri; JAV, Javanica; CEL, Celddoni; DJA, Djasiman; AUT, Autumnalis (Picardeau 2013).

Figure 8 - Répartition dans l’année des cas de leptospirose en Métropole.

26

Dans les régions tropicales, les personnes habituellement les plus exposées sont celles ayant des activités professionnelles agricoles (travail dans les rizières, bananeraies, champs de canne à sucre, élevage du bétail), mais de nombreux cas surviennent aussi lors d’activités quotidiennes (jardinage, marche pied nu, ingestion d’eau contaminée) (Cacciapuoti 1987; Levett 2001). La leptospirose est un problème de santé publique émergent, en particulier du fait de l’expansion non contrôlée de la population des bidonvilles dans de nombreux pays tropicaux (WHO 2011). Les conditions de vie dans ces bidonvilles, la pauvreté, l’insalubrité, la surpopulation, et la présence de rats, rendent leurs habitants particulièrement vulnérables. (Johnson 2004; Riley 2007; Reis 2008). Dans une étude réalisée à Salvador au Brésil, les habitants d’une favela avait un risque élevé de faire une leptospirose (>3% par an) avec un risque maximum pour les hommes et les habitants ayant les plus bas revenus, et la réinfection était fréquente chez ceux vivant à proximité d’égouts à ciel ouverts (Felzemburgh 2014). D’ici 2020, la population des bidonvilles devrait atteindre 1,4 milliards et l’OMS anticipe une augmentation de l’impact sanitaire de la leptospirose sur ces populations (Lau 2010). Enfin, à côté des expositions professionnelles et occupationnelles précédemment citées, les loisirs aquatiques exposent les pratiquants au risque de leptospirose et des cas groupés ont été rapportés après la pratique d’activités comme la nage en rivière ou le rafting (CDC 1997; Katz 1997). Le développement des compétitions sportives en milieu tropical, qui s’accompagnent de regroupement important de participants, créent des conditions potentielles pour des expositions de masse (Sejvar 2003). La survie prolongée des leptospires dans l’environnement est favorisée par l’humidité et par les températures élevées avec pour conséquence des augmentations d’incidence pendant la saison des pluies ou au décours des événements climatiques exceptionnels (inondations, cyclones), en favorisant un contact plus étroit entre les bactéries, leurs hôtes animaux et les humains (Ko 1999; Sarkar 2002; Lau 2010). De nombreuses épidémies de leptospirose ont ainsi été rapportées après des événements climatiques exceptionnels en Asie, en Amérique latine et sur des îles du Pacifique (Lau 2010). Ainsi au Brésil, plus de 10 000 cas de leptospirose sévère sont rapportés annuellement en rapport avec les épidémies urbaines associées aux saisons des pluies (McBride 2005). La saisonnalité de la maladie et l’influence des paramètres météorologiques a été étudiée à la Réunion par modélisation de séries temporelles sur la période 1998-2008 : le nombre mensuel de cas de leptospirose était lié à la température moyenne et à l’insolation du même mois et à la pluviosité des 2 mois précédents (Desvars 2011). En Guadeloupe, une augmentation du nombre de cas a été observé entre 2003 et 2005 suivant les saisons particulièrement chaudes et humides associées à 2 phénomènes El 27

Nino (Storck 2008). Une autre étude de séries temporelles réalisée en Nouvelle Calédonie sur la période 2000-2012, a montré que le phénomène La Nina était associé à une forte pluviosité et que ces 2 facteurs étaient liés temporellement avec des épidémies de leptospirose (Weinberger 2014). En réduisant l’étendue des eaux de surface par évaporation et en encourageant les activités aquatiques, les fortes températures provoquent un regroupement des activités humaines et animales au niveau des points d’eau, favorisant ainsi des conditions favorables à la transmission (Lau 2010). Les modifications attendues du climat en particulier dans les régions tropicales, la multiplication des événements climatiques extrêmes et l’élévation des températures, font craindre qu’une proportion croissante de la population soit exposée au risque de leptospirose dans les années à venir (McMichael 2006). Compte tenu de leur vulnérabilité, les zones où l’élévation du risque sera le plus marquée pourraient être les grandes zones urbaines avec bidonvilles, les zones côtières de basse altitude et les petites îles tropicales (Lau 2010). Pour ce qui est des départements et territoires ultramarins, 618 cas ont été recensés en 2013 (Martinique, Guadeloupe, Guyane, Polynésie, Mayotte, La Réunion, Nouvelle Calédonie) par le CNRL (Tableau 3, Figure 1). L’incidence est de 15 fois (La Réunion) à plus de 50 fois (Martinique, Guadeloupe, Mayotte,

Polynésie Française) plus élevée qu’en

Métropole (Picardeau 2013). Le sérogroupe Icterohaemorrhagiae est dominant dans la plupart des régions. Une étude d’incidence a été menée aux Antilles, par la CIRE Antilles-Guyane et l’INVS, en coopération avec le CNRL, entre le 1er janvier et le 31 décembre 2011 afin de disposer d’informations fiables permettant d’estimer le poids réel de la maladie aux Antilles. En prenant en compte les cas hospitalisés et les cas ambulatoires (médecins sentinelles), l’incidence a été estimée à 61 et 70/100 000 en Martinique et en Guadeloupe respectivement avec une recrudescence marquée au 2eme semestre pendant la saison la plus humide (Cassadou 2013).

28

Tableau 3 - Répartition des cas dans les régions d’Outre-Mer en 2013 (Picardeau 2013).

Figure 9 - Nombre de cas de leptospirose en France métropolitaine et en outre-mer par année (Picardeau 2013).

29

1.3 Physiopathologie L’infection de l’hôte par des leptospires pathogènes peut conduire à des manifestations cliniques d’intensité très variables, depuis la forme infraclinique jusqu’à l’hémorragie pulmonaire potentiellement mortelle. Bien que la physiopathologie de la leptospirose soit encore incomplètement comprise, on considère habituellement qu’elle résulte des effets directs de la bactérie et des effets de la réponse immune de l’hôte. L’importance de l’inoculum au moment de l’exposition, la virulence de la souche infectante, et les facteurs génétiques de l’hôte semblent des éléments déterminants pour expliquer la pénétration des leptospires, leur diffusion dans l’organisme, les lésions tissulaires observées, et la colonisation persistante des tubules rénaux (Levett 2001; Bharti 2003). 1.3.1 Inoculum Dans des conditions favorables te températures et d’humidité, comme c’est le cas en région tropicale, les leptospires peuvent survivre pendant plusieurs semaines sous la forme d’agrégats (Trueba 2004). La mise en évidence des leptospires dans l’environnement est cependant très délicate et des résultats négatifs peuvent être liés à l’absence de leptospires dans le milieu mais aussi à une quantité inférieure au seuil de détection ou à la présence de contaminants. Une étude réalisée dans la région amazonienne du Pérou a comparé des zones rurales et urbaines avec une approche environnementale quantitative (PCR en temps réelle) et moléculaire (séquençage de l’ARN 16S) (Ganoza 2006). Les auteurs ont montré que les cas de leptospiroses sévères survenant en zone urbaine étaient associés à la présence dans l’environnement d’une quantité 20 fois supérieure des leptospires les plus pathogènes. 1.3.2 Facteurs de virulence bactériens Le genre Leptospira est composé d’espèces pathogènes (ex L. interrogans) et d’espèces non pathogènes (ex L. biflexa). Leptospira biflexa, présente dans les environnements aquatiques, est la première espèce saprophyte à avoir été séquencée et son génome a été comparé à celui des 2 espèces pathogènes L. interrogans et L. borgpetersenii (Picardeau 2008). Ce travail a permis de mettre en évidence 2052 gènes (61%) communs avec les espèces pathogènes, on y retrouve des gènes de ménage mais aussi des gènes de fonctions inconnues. L’identification de gènes communs aux 2 espèces pathogènes mais absents dans L. biflexa témoignerait de leur implication dans la pathogenèse. Une majorité de ces gènes est de

30

fonctions inconnues alors que d’autres codent pour des hémolysines, des protéases, ou des lipoprotéines de membrane (Bourhy 2012). Parmi les gènes identifiés après séquençage de Leptospira interrogans, au moins 50 seraient liés à la mobilité qui semble un facteur de virulence majeur dans l’infection initiale et la dissémination dans l’organisme (Ren 2003). La comparaison des séquences génomiques de L. borgpetersenii et L. interrogans, 2 des espèces pathogènes les plus fréquemment rencontrées chez l’homme, montre que le premier génome est plus court et moins dense en séquence codante dans des régions qui semblent liées à la survie dans l’environnement (Bulach 2006). Selon les auteurs de ce travail, L. borgpetersenii pourrait ainsi évoluer vers un cycle de transmission strictement inter-hôte (Les infections à L.borgpetersenii serovar Hardjo sont restreintes au bétail et aux moutons) à la différence de L.interrogans dont le cycle de transmission fait intervenir de longs passages dans l’environnement aquatique avant de rencontrer un hôte mammifère. Parmi les espèces pathogènes, L. interrogans sérogroupe Icterohaemorrhagiae semble être plus souvent associée à la sévérité (Levett 2001; Herrmann-Storck 2010). Les stratégies pour mettre en évidence les déterminants de virulence cherchent à identifier des protéines exprimées à la surface, comme la porine OmpL1 ou la lipoprotéine Lip21, en utilisant les données génomiques disponibles grâce au séquençage et aux techniques de protéomiques (Cullen 2003; Nascimento 2004). Parmi les nombreux facteurs étudiés, on peut citer l’antigène O du LPS dont la régulation pourrait déterminer le caractère aigu ou persistant de l’infection rénale et les protéines Lig (leptospiral immunoglobin-like protein), identifiées chez les espèces pathogènes uniquement et exprimées à leur surface qui pourraient jouer un rôle majeur dans la virulence lors de l’adhésion initiale et l’invasion (Palaniappan 2002; McBride 2005; Nally 2005). 1.3.3 Facteurs liés à l’hôte L’évolution clinique de la maladie et les données anatomo-pathologiques suggèrent la participation d’un processus immunopathogène (Faine 1999). Nous n’avons pas encore une connaissance détaillée des mécanismes de l’immunité de l’hôte, mais l’immunité à médiation humorale semble la principale réponse à l’infection naturelle, une immunité passive peut être conférée par les seuls anticorps et l’immunité acquise naturellement est uniquement restreinte au sérovar homologue ou aux sérovars les plus proches (Levett 2001). Par ailleurs, l’immunité à médiation cellulaire, en particulier les lymphocytes T g-d, pourrait jouer un rôle important dans la réponse pro-inflammatoire (McBride 2005). 31

L’existence d’une susceptibilité plus grande à la leptospirose chez certains individus n’a été rapportée que dans quelques études à ce jour. Dans les suites d’un triathlon comprenant une épreuve de natation dans un lac de l’Illinois (USA) en 1998, plus de 50 personnes ont contracté la leptospirose et il a été montré que l’ingestion d’eau du lac et la présence d’un variant du système Human Leukocyte Antigen (HLA DQ6) étaient associés à un risque accru de développer la leptospirose (Lingappa 2004). Une autre équipe a montré qu’un polymorphisme des gènes codant les interleukines 4 (IL4) et IL4Rα était associé à la sensibilité à la leptospirose (Fialho 2009). 1.3.4 Principales lésions tissulaires au cours de la leptospirose L’étude des modèles animaux et les séries autopsiques mettent en évidence la présence de lésions de vascularite, d’une atteinte endothéliale et d’infiltrats inflammatoires au niveau du foie, des reins, du cœur et des poumons. Dans une série autopsique indienne de 62 cas, les saignements étaient au premier plan dans de nombreux tissus et organes, en particulier au niveau pulmonaire. Les principales atteintes étaient une hémorragie intra-alvéolaire massive (48 cas) considéré comme la cause du décès, une néphrite interstitielle parfois associée à une nécrose tubulaire aigue (45 cas) et une myocardite (24 cas) (Salkade 2005). L’atteinte rénale est une néphrite interstitielle aiguë avec atteinte initiale de la fonction tubulaire, défaut de réabsorption proximal du sodium et augmentation de l’excrétion distale du potassium qui conduit à une hypokaliémie caractéristique (Figure 10)(Andrade 2008). Au cours de l’atteinte hépatique, l’ictère n’est pas associé à une nécrose hépatocellulaire massive (au contraire de ce qui est observé dans une hépatite virale) et les fonctions hépatiques reviennent à la normale après la convalescence (Figure 11). La physiopathologie de l’atteinte pulmonaire semble liée à un phénomène auto-immun plutôt qu’à une atteinte directe liée à la bactérie et se manifeste par des hémorragies intra-alvéolaires et interstitielles (Figure 12)(Abdulkader 2002; Nally 2004; McBride 2005). Dans les muscles cardiaques et squelettiques des lésions de myocardites et des foyers de myosites peuvent être observés, respectivement. Un mécanisme d’autoimmunité semble aussi responsable de l’atteinte ophtalmologique qui peut survenir plusieurs semaines après le début des symptômes (Bharti 2003).

32

Figure 10 - Atteinte rénale dans un modère animal. a et b: Reins d’un cochon d’Inde sain. On note les tubules normaux et les glomérules (G) dans le cortex. H&E, grossissement, x40 (a) et x100 (b). c–h: Reins d’un cochon d’Inde infecté. c et d: Infiltrats inflammatoires interstitiels, avec neutrophiles (flèche) présents dans des régions avec nécrose tubulo-interstitielle. H&E, grossissement, x40 (c) and x100 (d). e : coloration argentée montrant des leptospires. Grossissement, x200. f: Contrôle négatif pour la coloration IH des leptospires. Grossissement, x100. g et h: Coloration IH montrant des spirochères dans et autour des tubules. Grossissement, x100 (g et h) (Nally 2004).

33

Figure 11 - Atteinte hépatique dans un modèle animal.

a et b: Foie d’un cochon d’Inde sain. On note les travées et les espaces sinusoïdaux. H&E, grossissement, x40 (a) et x200 (b). c–i: Foie d’un cochon d’Inde infecté. c et d: Distorsion de l’ architecture avec perte de la cohésion des travées, et nécrose des hépatocytes (N). e: Augmentation des macrophages (flèche) dans les sinusoïdes. H&E, grossissement, x40 (c), x100 (d), and x200 (e). f: Coloration argentée des leptospires. Grossissement, x400. g: Contrôle de coloration négatif IH des leptospires. Grossissement, x100. h et i: Coloration IH montrant de nombreux leptospires le long des hépatocytes. Grossissement, x200 (h) et x400 (i) (Nally 2004).

34

Figure 12 - Atteinte pulmonaire dans un modèle animal. (A) Hémorragie pulmonaire chez un cochon d’inde infecté par une souche de Leptospira interrogans serovar copenhageni obtenue à partir d’un patient Brésilien atteint de leptospirose avec hémorragie pulmonaire. (B) Poumon d’un cochon d’inde normal pour comparaison. D’après référence (Bharti 2003).

35

1.4 Manifestations cliniques La leptospirose se distingue par un très grand polymorphisme clinique, de la forme anictérique observée dans 90 % des cas jusqu’à la défaillance multiviscérale potentiellement mortelle caractérisée par l’association d’un ictère, d’une insuffisance rénale et d’hémorragies viscérales (Levett 2001). A l’occasion d’épidémies survenues au Nicaragua, au Pérou ou en Thaïlande, des études de séroprévalences ont rapporté que l’infection asymptomatique pouvait survenir dans 60-70% des cas chez l’homme vivant en zone d’endémie, et pouvait être associée à l’excrétion asymptomatique des leptospires dans les urines (Ashford 2000; Phraisuwan 2002; Ganoza 2010). L’incubation est de 10 jours en moyenne (3 à 30 j). Selon une description classique, l’évolution de la leptospirose est biphasique avec une phase septicémique la première semaine des symptômes, suivie d’une brève défervescence thermique puis d’une phase immunologique caractérisée par une reprise de la fièvre, la survenue éventuelle de complications, l’apparition des anticorps et l’excrétion de leptospires dans les urines (Levett 2001). Dans la pratique courante, il est souvent très difficile de distinguer ces phases, les patients pouvant se présenter d’emblée avec des complications viscérales. Les hommes sont beaucoup plus souvent malades et représentent plus de 80 % des cas de leptospirose en particulier dans la tranche d’âge active de 20 à 50 ans, quelle que soit la zone géographique (Yersin 1998; Katz 2001; Herrmann-Storck 2005). Cette prédominance masculine semble surtout liée à une surreprésentation des hommes dans les activités professionnelles et de loisir à fort risque d’exposition (Katz 2001). Lors de l’étude d’incidence réalisée aux Antilles en 2011, les hommes étaient plus souvent concernés par la maladie (sexe-ratio de 6,2 pour la Martinique) et la tranche d’âge la plus touchée était la tranche des 20-59 ans (Cassadou 2013). 1.4.1 Forme anictérique pseudo-grippale C’est la forme clinique la plus fréquente et les principaux symptômes sont une fièvre de survenue brutale, des céphalées et des myalgies intenses (Levett 2001; Bharti 2003). L’absence de spécificité de cette présentation explique en partie le sous diagnostic de la leptospirose en zone d’endémie. Dans les grandes séries publiées, les signes et symptômes rapportés lors de l’admission à l’hôpital associent une fièvre de début brutal à plusieurs des signes suivants : céphalées (70-98 %), myalgies (40-100 %), suffusion conjonctivale (28,5-99 36

%), manifestations digestives (ictère [0-95 %], anorexie [46-92 %], vomissements [18-69 %], douleurs abdominales [26-43 %], diarrhée [11-36 %]), et des manifestations respiratoires (toux [20-57 %], hémoptysies [9-51 %]) (Levett 2001; Bharti 2003; Bourhy 2012). Les myalgies habituellement intenses (région lombaire, cuisses, mollets) sont liées à une rhabdomyolyse avec élévation marquée des CPK. La présence d’une hépatomégalie (15 %-83 %), d’adénopathies (19 %-49 %) ou d’une éruption cutanée (2 %-7 %) est moins souvent rapportée. Parmi les signes cités précédemment, l’association d’une suffusion conjonctivale (œil rouge sans trouble visuel ni écoulement purulent), d’un ictère conjonctival et de myalgies au niveau des mollets et des lombes semblent assez spécifiques de la leptospirose (Levett 2001). 1.4.2 Complications viscérales Les complications décrites dans ce chapitre peuvent être isolées mais sont le plus souvent associées dans le cadre d’une défaillance multiviscérale, c’est-à-dire caractérisée par la défaillance d’au moins 2 organes. La survenue de complications viscérales est rapportée dans 5 % à 15 % des cas et les formes les plus sévères sont le syndrome de Weil et le syndrome hémorragique pulmonaire (Bharti 2003). Défaillance hépatique et rénale Historiquement, la manifestation la plus caractéristique de la leptospirose sévère est l’atteinte hépato-rénale associée à des manifestations hémorragiques ; cette association est décrite sous le nom de syndrome de Weil avec un taux de mortalité pouvant atteindre 15 % (Levett 2001). Chez les patients ictériques, qui représentent 5 % à 10 % des patients atteints de leptospirose, le bilan biologique met en évidence une élévation parfois majeure de la bilirubine conjuguée (qui peut dépasser 500 µmol/l), souvent associée à une élévation moins marquée des transaminases ou des phosphatases alcalines. L’atteinte hépatique est habituellement réversible sans séquelles, la disparition de l’ictère et la normalisation du bilan hépatique peuvent cependant prendre plusieurs semaines. L’insuffisance rénale est observée au cours de la leptospirose dans 16 % à 40 % des cas selon les séries, elle est habituellement non-oligurique, associée à une hypokaliémie caractéristique, et nécessite un traitement par dialyse dans les cas les plus sévères (Seguro 1990; Abdulkader 1996; Andrade 2008). Dans une étude réalisée au Brésil lors d’une épidémie urbaine, une hypokaliémie était mise en évidence dans 54 % chez 116 patients 37

atteints de leptospirose (Ko 1999). Au stade tardif, l’atteinte rénale évolue vers une insuffisance rénale oligurique parfois associée à une hyperkaliémie, et nécessitant une prise en charge par hémodialyse (Panaphut 2002; Bharti 2003). Lorsque les patients peuvent bénéficier d’une prise en charge adaptée, la dysfonction rénale au cours de la leptospirose est habituellement complètement réversible (Andrade 2008). La thrombopénie est observée dans plus de 50 % des cas et est souvent corrélée à l’apparition de l’insuffisance rénale. Elle semble survenir en l’absence de coagulation intravasculaire disséminée (Bharti 2003). Manifestations pulmonaires Les manifestations pulmonaires sont rapportées dans 20 % à 70 % des cas selon les études, de la simple toux associée ou non à une hémoptysie jusqu’au syndrome de détresse respiratoire aiguë nécessitant une assistance respiratoire (O'Neil 1991) (Paganin 2009). La forme la plus sévère est un syndrome hémorragique pulmonaire (severe pulmonary hemorrhage syndrome [SPHS] ou leptospirosis-associated pulmonary hemorrhage syndrome [LPHS]) lié à une hémorragie intra-alvéolaire et à l’origine d’hémoptysies et d’un syndrome de détresse respiratoire aigüe avec un taux de mortalité pouvant dépasser 50 % (Figure 13) (Park 1989) (Zaki 1996) (Trevejo 1998; Yersin 2000; Segura 2005; Paganin 2007; Gouveia 2008). Ces atteintes pulmonaires sévères sont plus souvent rapportées depuis les années 1990 et ont été décrites y compris en l’absence des classiques défaillances hépatiques et rénales (Trevejo 1998; Marotto 1999; Segura 2005). Dans une étude réalisée à La Réunion chez 147 patients atteints de leptospirose, une atteinte pulmonaire (définie par une hémorragie alvéolaire massive ou deux signes parmi : dyspnée, toux, douleur thoracique, râles pulmonaires ou hémoptysies) était rapportée chez 85 % des cas (Paganin 2007). Parmi les 38 patients ayant eu un lavage bronchoalvéolaire à l’admission, 31 (81 %) avaient une hémorragie alvéolaire, dont 12 (39 %) avec une radiographie pulmonaire normale. La radiographie pulmonaire était anormale chez 65 % des patients et la majorité avait une atteinte interstitielle bilatérale ; l’atteinte alvéolaire étant un signe de sévérité. Selon les auteurs, l’hémorragie pulmonaire pourrait donc être constante dans la leptospirose mais rester parfaitement asymptomatique dans les formes mineures (Paganin 2009).

38

Figure 13 - Radiographie thoracique d’un patient présentant une hémorragie intra-alvéolaire au cours d’une leptospirose sévère. Manifestations cardiaques L’atteinte cardiaque peut se manifester par des anomalies de l’électrocardiogramme (ECG), le plus souvent sans dysfonction ventriculaire gauche, et dans les formes les plus sévères par une myocardite responsable d’une insuffisance cardiaque (Levett 2001). Dans une étude indienne réalisée chez 50 patients atteints de leptospirose avec un suivi cardiologique, des anomalies ECG étaient constatées chez 70 % des patients. Des troubles de conduction étaient observés dans 36% des cas et la fibrillation auriculaire était le trouble du rythme le plus fréquent. Cependant la fonction ventriculaire gauche évaluée par échocardiographie était toujours normale (Rajiv 1996). Ainsi, si les anomalies ECG sont fréquemment observées au cours de la leptospirose, la dyspnée et l’hypotension sont le plus souvent d’origine extracardiaque. Les études autopsiques révèlent l’existence de myocardites interstitielles dans plus de 50 % des cas, mais dans ce contexte, il est rarement possible d’affirmer que l’atteinte 39

cardiaque était l’unique cause du décès dans un contexte de défaillance multiviscérale (Ramachandran 1977; de Brito 1987). Manifestations neurologiques La méningite aseptique est la manifestation neurologique la plus fréquente, en particulier chez les enfants et adultes jeunes (Levett 2001). Cette atteinte n’est pas associée à la gravité de la maladie et ne nécessite pas un traitement antibiotique spécifique. Les patients symptomatiques présentent un syndrome méningé fébrile (céphalées rétro-orbitaires, vomissements, raideur de nuque) et la ponction lombaire met en évidence une pléiocytose lymphocytaire, une hyperprotéinorachie modérée et une normoglycorachie. Dans ce contexte, la réalisation systématique d’une ponction lombaire n’est donc pas nécessaire si le diagnostic de leptospirose est confirmé. Des complications neurologiques rares et sévères ont été rapportées: hémorragie intracérébrale, accident vasculaire cérébral, syndrome de GuillainBarré (Forwell 1984) (Morgan 1980; Lessa 1981). Manifestations ophtalmologiques La suffusion conjonctivale, généralement bilatérale, est un signe physique très fréquent au cours de la leptospirose ; elle se distingue de la conjonctivite classique par l’absence de douleurs et d’écoulement purulent. L’association d’une suffusion conjonctivale et d’un ictère conjonctival serait très évocatrice du diagnostic (Levett 2001). La complication ophtalmologique caractéristique est l’uvéite qui peut être unilatérale ou bilatérale, avec atteinte du segment antérieur ou de tous les segments (panuvéite). Elle peut survenir dès la deuxième semaine d’évolution jusqu’à plusieurs mois après la phase fébrile et semble être la seule complication tardive de la leptospirose (Rathinam 2005). Des cas groupés de panuvéites bilatérales ont été rapportés en Inde dans un contexte épidémique après une période d’inondation (Rathinam 1997; Rathinam 2005). D’autres manifestations plus rares ont été rapportées comme la choriorétinite, la papillite, la névrite optique et l’hémorragie rétinienne (Rathinam 2005).

40

1.4.3 Facteurs pronostiques de décès au cours de la leptospirose La mortalité varie de 5 % à plus de 20 % dans les principales séries publiées en zone d’endémie avec de grandes disparité selon les zones géographiques et surtout le type de défaillance viscérale observée, les défaillances rénales et pulmonaires étant le plus sévères (Everard 1984; Park 1989 ; Dupont 1997; Ko 1999 ; Panaphut 2002; Esen 2004). Dans une étude réalisée en Thaïlande, le taux de mortalité était nul chez les patients sans insuffisance rénale, de 6 % chez les patients présentant une insuffisance rénale sans ictère, et de 20 % chez les patients présentant un syndrome de Weil (défaillance hépato rénale) (Panaphut 2002). Dans une autre étude réalisée au Brésil, le taux de mortalité était respectivement de 18 %, 24 % ou 55 % selon que les patients présentaient une atteinte rénale isolée, une atteinte pulmonaire isolée ou une combinaison des deux (Spichler 2008). Dans le travail thaïlandais précédemment cité, les auteurs ont étudié prospectivement les facteurs pronostiques de décès au cours de la leptospirose chez 121 patients sérologiquement confirmés (Panaphut 2002). Dans cette étude, 17 (14%) décès étaient rapportés et la présence d’une hypotension, d’une oligurie, d’une hyperkaliémie ou de râles pulmonaires à l’admission ont été identifiés comme des facteurs pronostiques indépendants de décès. L’hémorragie pulmonaire et le syndrome de détresse respiratoire aiguë étaient les principales complications associées au décès, suivies par l’insuffisance rénale compliquée et la défaillance multiviscérale. Dans les principales études rétrospectives publiées à ce jour, les 2 facteurs indépendants les plus souvent associés au décès sont comme précédemment la survenue d’une atteinte rénale (oligurie, anurie, hyperkaliémie) ou d’une atteinte respiratoire (dyspnée, insuffisance respiratoire, présence d’infiltrats pulmonaires radiologiques, hémorragie pulmonaire, nécessité d’une ventilation mécanique) (Dupont 1997; Daher 1999; Ko 1999; Marotto 1999; Tantitanawat 2003; Paganin 2007; Spichler 2008; Herrmann-Storck 2010). Les autres facteurs identifiés sont la présence d’un choc, les anomalies ECG, l’altération de la conscience et l’âge avancé (Esen 2004). La thrombopénie, souvent observée au cours de la leptospirose, a été identifiée comme un facteur prédictif indépendant de la mortalité dans 2 études réalisées respectivement au Brésil (<70 000) et en Thaïlande (<100 000) (Tantitanawat 2003; Spichler 2008).

41

1.4.4 Diagnostic différentiel En l’absence de présentation clinique spécifique, la confusion initiale avec d’autres pathologies infectieuses est possible, en particulier en zone tropicale avec le paludisme ou une arbovirose (Zaki 1996; Bharti 2003). L’atteinte pulmonaire ou la survenue d’hémorragies peuvent faire évoquer selon région géographique une infection à Hantavirus ou une fièvre hémorragique virale (Antoniadis 1995; Monsuez 1997). Dans une étude réalisée en 2001 à Dhaka au Bangladesh lors d’une épidémie de dengue, 18% des patients testés négatifs pour la dengue étaient testés positifs pour la leptospirose (LaRocque 2005). Lors d’une épidémie urbaine de leptospirose survenue en 1996 à Salvador (Brésil) pendant la saison des pluies, et concomitante d’une épidémie de dengue, un diagnostic initial de dengue était porté chez plus de 40 % des cas confirmés de leptospirose (Ko 1999). Un diagnostic initial erroné de dengue était associé à une prescription tardive du traitement antibiotique lorsque le diagnostic de leptospirose était finalement porté, et une évolution plus sévère de la maladie (Flannery 2001). L’importance de moyens diagnostics permettant un diagnostic rapide des 2 maladies était souligné dans ces différentes études.

42

1.5 Diagnostic biologique Devant un patient fébrile, un diagnostic précoce est essentiel puisque l’antibiothérapie est d’autant plus efficace qu’elle est débutée précocement dans l’évolution de la maladie (Faine 1999; WHO 2003). Comme vu précédemment, la présentation clinique initiale souvent non spécifique de la leptospirose nécessite des outils diagnostics rapides et facilement accessibles pour la distinguer de pathologies comme la dengue en zone d’endémie (LaRocque 2005). 1.5.1 Les tests biologiques usuels Les perturbations biologiques observées sur le bilan « standard » (numération formule sanguine, bilan biochimique, marqueurs de l’inflammation) permettent d’orienter la recherche étiologique et de dépister des défaillances d’organes. La présence fréquente d’une hyperleucocytose à polynucléaires neutrophiles associée à une forte élévation de la CRP permettent d’évoquer une infection bactérienne (association absente dans les infections virales aigues comme la dengue). Une thrombopénie est observée dans plus de 50 % des cas et ne semble pas liée à un phénomène de coagulation intravasculaire disséminée (Edwards 1986; Bharti 2003). L’association d’une altération de la fonction rénale et d’une hypokaliémie est caractéristique. Dans les formes plus sévères, on peut observer selon le type de défaillance : une élévation de la créatinine (défaillance rénale), une forte élévation de la bilirubine totale et conjuguée, une cytolyse hépatique, une acidose, et une élévation du taux de créatine phosphokinase (rhabdomyolyse) (Seguro 1990; Dupont 1997; Coursin 2000; Andrade 2008). 1.5.2 Cinétique des leptospires et des anticorps dans le sang Au cours de la leptospirose on peut décrire 2 phases distinctes. La phase aigüe ou septicémique au cours de laquelle on peut mettre en évidence l’ADN bactérien dans le sang dure habituellement de 7 à 10 jours (Levett 2001). Ensuite, la phase immune débute une semaine après le début des symptômes et correspond à l’apparition des anticorps et la disparition des bactéries dans le sang (Figure 14). Compte tenu de cette cinétique, il apparait que la recherche d’ADN dans le sang peut être négative si la leptospirémie est faible (en dessous du seuil de détection), si le prélèvement est tardif ou réalisé après administration d’antibiotiques qui éliminent rapidement les leptospires du sang. En miroir, un prélèvement

43

sérologique pratiqué pendant la phase aigüe, avant l’apparition des anticorps, sera faussement négatif.

Figure 14- Evolution schématique de la leptospirémie et des anticorps au cours de la leptospirose (Picardeau 2013).

1.5.3 Diagnostic bactériologique direct : mise en évidence des leptospires ou de leur ADN Détection de l’ADN bactérien par amplification génique (PCR)

Les techniques d’amplification génique (PCR conventionnelle ou PCR en temps réel) développées ces 20 dernières années permettent aujourd’hui de confirmer le diagnostic dans les premiers jours de la maladie, au moment où le traitement antibiotique à le plus de chance d’être efficace (Levett 2001).

Ces techniques restent cependant encore insuffisamment

accessibles dans les pays en développement où un diagnostic rapide est pourtant primordial (McBride 2005). La RT-PCR a l’avantage d’être rapide et d’avoir une bonne sensibilité (de l’ordre de 102-103 bactéries/ml de sang). Compte tenu de la cinétique précédemment décrite, la PCR doit être prescrite précocement pendant la première semaine des symptômes, de préférence avant toute antibiothérapie. Une PCR négative peut donc être le résultat d’une bactériémie inférieure au seuil de détection ou d’un prélèvement trop tardif. Parmi les nombreuses méthodes publiées, on cite les PCR en temps réel ayant pour cible les gènes spécifiques de leptospires pathogènes lipL32 et Lfb1 (LFB pour Leptospira fibronectin

44

binding protein 1) (Merien 2005; Stoddard 2009). Cette dernière méthode a été mise au point à l’Institut Pasteur en Nouvelle Calédonie et est actuellement utilisée en Martinique (Janaud 2007). En pratique courante, seule les prélèvements sanguins sont utilisés mais la technique peut aussi être pratiquée sur le LCR (6e j après le début de maladie) ou les urines (7e j après le début de maladie) (Figure 15). Pour la recherche par PCR, le sang est recueilli sur tube d’acide ethylène-diamine tétra-acétique (EDTA) (Figure 16). Les techniques PCR actuelles permettent de détecter les leptospires pathogènes mais sans caractérisation de l’espèce, du sérogroupe ou du sérovar. Cependant, l’analyse de la courbe de fusion de la technique de RTPCR ciblant lfb1 semble pouvoir donné des premières informations puisque qu’elle semble pouvoir différentier L.interrogans des autres especes pathogènes (Figure 17) (Merien 2005; Bourhy 2011). A l’heure actuelle, il reste donc capital d’essayer d’isoler les leptospires en culture afin de pouvoir identifier les souches circulantes. Examen microscopique direct Cet examen, non réalisé en pratique courante, doit être réalisé précocement pendant la première semaine et nécessite le recours à un microscope à fond noir car les leptospires ne sont pas visualisés avec les colorations usuelles comme le Gram. Les leptospires apparaissent comme des bactéries fines et longues, très mobiles et le plus souvent avec des crochets à leurs extrémités (Figure 3). Cet examen est difficile car le seuil de détection est de l’ordre de 104 bactéries/ml et le risque de faux positif induit par les débris cellulaires est important. Les leptospires peuvent être visualisés par immunohistochimie ou après coloration argentique (Warthin-Starry) dans les tissus (foie et rein principalement), mais ces techniques ne sont pas utilisées dans la pratique courante (Bourhy 2012). Culture La culture a une place fondamentale dans l’identification des souches circulantes mais c’est une technique fastidieuse et inappropriée pour le diagnostic précoce de la maladie. L’ensemencement doit se faire pendant la première semaine de la maladie, le plus rapidement possible après le prélèvement sanguin, sur tube hépariné, et avant toute prescription d’antibiotiques (Postic 2000) (Figure 16). Selon la chronologie de la maladie la culture peut aussi être réalisée à partir du LCR ou des urines (à partir du 7° jour) mais ces 2 derniers prélèvements sont moins rentables et peu pratiqués (Figure 15). Le milieu de culture le plus utilisé est le milieu EMJH (Ellinghausen-McCullough modifié par Johnson-Harris) 45

(Ellinghausen 1965; Johnson 1967). Des dilutions dans plusieurs tubes de 10 ml d’EMJH sont nécessaires afin de limiter le pouvoir inhibiteur des cellules sanguines dans le milieu. Les cultures sont ensuite incubées à une température de 28 à 30 ◦C à l’obscurité et sont observées chaque semaine au microscope à fond noir pendant 2 mois, ce qui rend la technique longue et fastidieuse. En France, les cultures positives peuvent être adressées au CNRL (Centre national de référence de la leptospirose, Institut Pasteur) pour identification définitive des leptospires (Bourhy 2012).

46

Figure 15 - Cinétique de la leptospirose au cours de l’infection. L’infection entraîne une bactériémie durant les premiers jours de l’infection. Suite à l’augmentation du titre des anticorps agglutinants (phase immune), les leptospires sont éliminés de la circulation sanguine. Les leptospires sont aussi retrouvés dans le liquide céphalorachidien et de manière transitoire dans les urines. MAT : microscopic agglutination test ; Elisa : enzyme-linked immunosorbent assay ; PCR : polymerase chain reaction ; LCR : liquide céphalorachidien (Bourhy 2012).

47

Figure 16 - Détection des leptospires à partir de prélèvements sanguins par culture ou amplification génique. EDTA : acide éthylène-diamine tétra-acétique ; ADN : acide désoxyribonucléique ; EMJH : milieu Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (Bourhy 2012).

48

Figure 17 - Courbes de fusion Leptospira interrogans serovar Icterohaemorrhagiae (courbe du haut) et Leptospira borgptersenii serovar Castelloni (courbe du bas)

49

1.5.4 Diagnostic sérologique La mise en évidence des anticorps spécifiques est possible à partir du 5e jour après l’apparition des symptômes et doit se faire sur du sérum (Figure 15). Toute réaction de dépistage (ex : ELISA IgM) doit être confirmée par la technique de référence (MAT). Le diagnostic biologique de la leptospirose a été l’objet d’un rapport d’évaluation publié par la HAS en 2011 (HAS 2011). Test de dépistage Les

réactions

de

type

Enzyme-Linked

Immunosorbent

Assay

(Elisa)

immunoglobulines M (IgM) (trousses commercialisées ou préparation « maison ») sont sensibles et relativement spécifiques (Trombert-Paolantoni 2009; Bourhy 2012). L’Elisa se positive plus précocement que le MAT (J5/J6) et permet d’aider à différencier une leptospirose évolutive d’une maladie antérieure grâce à la mise en évidence des IgM (Figure 14). Tout résultat positif ou douteux par Elisa nécessite une confirmation par le test de référence MAT. La macroagglutination avec l’antigène thermorésistant (TR), malgré l’intérêt potentiel lié à sa rapidité d’exécution et son faible coût manque de sensibilité (62 %) et de spécificité (84 %) et n’est plus recommandée (Picardeau 2008). Confirmation par le test de référence : Microscopic Agglutination Test (MAT) Le test de micro-agglutination consiste à évaluer au microscope à fond noir le degré d’agglutination de cultures de leptospires vivantes par le sérum de malade (Martin 1918). Un sérum est considéré comme positif pour un antigène testé, à une dilution donnée, si au moins 50 % des leptospires sont agglutinés par rapport à un témoin antigène sans sérum. Depuis 2004, le titre seuil est fixé au 1/100 pour la métropole et au 1/400 pour les régions endémiques (Polynésie Française, Guadeloupe, Martinique, La Réunion, Mayotte, NouvelleCalédonie, Futuna) (Bourhy 2012). Le MAT se positive vers le J8/J10 avec un titre généralement plus élevé pour l’antigène L. biflexa souche Patoc et parfois de nombreuses coagglutinines pour plusieurs sérogroupes. Le MAT est une méthode spécifique de sérogroupe (et non de sérovar), elle nécessite l’entretien d’une collection de souches vivantes représentatives des principaux sérogroupes et qui serviront de batterie d’antigènes. Au CNRL, 16 souches sont utilisées (dont la souche non pathogène L. biflexa souche Patoc 1 qui a la particularité de croiser avec de nombreux antigènes de sérogroupes pathogènes) auxquelles 50

peuvent s’ajouter des souches locales dont le sérogroupe est spécifique, par exemple de certaines régions ultramarines (Bourhy 2012). C’est une technique complexe à mettre en œuvre et nécessitant une forte expertise tant dans sa réalisation que dans son interprétation. La confirmation d’un cas par le MAT nécessite deux prélèvements à 2 semaines d’intervalle avec une séroconversion ou une augmentation significative (au moins x 4) des titres d’anticorps. Compte tenu du nombre élevé de réactions croisées pendant la phase aigüe, un sérum tardif (> J 20) est nécessaire pour déterminer le sérogroupe présomptif ; l’identification définitive du sérogroupe nécessitant l’isolement de la souche pathogène en culture. Les anticorps peuvent persister des années après l’exposition initiale et une sérologie positive en MAT à un taux faible (ex 1/100) peut correspondre soit à un début de leptospirose, soit à la trace d’une infection ancienne, soit à des anticorps vaccinaux (Cumberland 2001). La confrontation du MAT avec un Elisa IgM permet alors de conclure. Une antibiothérapie très précoce peut conduire à un titre très limité voire négatif (Faine 1999). 1.5.5 Identification Le typage des souches pathogènes a un rôle épidémiologique de premier ordre puisque la détermination du sérogroupe ou du sérovar est le premier pas pour l’identification des réservoirs et l’établissement de stratégies de contrôle (McBride 2005). La détermination définitive du sérogroupe (sérotypie) se fait à partir des souches isolées en culture et repose sur la micro-agglutination avec une batterie de sérums de lapins correspondant aux principaux sérogroupes. Quand la culture n’est pas pratiquée, les résultats du MAT sont utilisés par défaut mais il n’y a pas toujours d’adéquation entre la détermination des sérogroupes après culture et celle déterminée par MAT à partir du sérum du patient du fait des possibles réactions croisées et phénomènes de coagglutination (Katz 2003; Levett 2003; Kusum 2005; Smythe 2009). En France, le CNRL de l’Institut Pasteur de Paris est le laboratoire référent pour l’identification des leptospires par sérotypie et différentes approches moléculaires (Cerqueira 2009). L’espèce génomique est déterminée par amplification, séquençage et analyse phylogénétique du gène codant l’ARNr 16S (Merien 1992). L’identification du sérovar a été longtemps réalisée par détermination du profil de macro-restriction de l’ADN génomique total par électrophorèse en champs pulsé (PFGE), cette méthode est très discriminante mais elle est fastidieuse (Herrmann 1992; Galloway 2010). Cette identification peut aujourd’hui se faire par des méthodes moléculaires plus rapide comme la Multi Locus Sequence Typing (MLST) ou la Multiple Loci Variable Number of Tandem Repeats (VNTR)

51

Analysis (MLVA) qui sont utilisables pour les espèces génomiques pathogènes les plus couramment rencontrées (L. interrogans, L. kirschneri et L. borgpetersenii) (Majed 2005; Ahmed 2006; Salaun 2006).

1.5.6 Conclusions du rapport d’évaluation de la HAS sur le diagnostic biologique de la leptospirose, 2011 Les conclusions de la HAS s’appuient sur un faisceau d’arguments prenant en compte les caractéristiques des tests mais aussi les données cliniques (HAS 2011). Sur cette base, deux des tests évalués trouvent leur place dans la stratégie diagnostique de la leptospirose : – La PCR en temps réel pour la première semaine de la maladie. La technique présente une excellente spécificité, son résultat est rapide ce qui est très important pour une maladie comme leptospirose. C’est le seul test biologique utilisable en pratique clinique pendant la première semaine de la maladie, la culture bactérienne n’étant pas adaptée en raison de son délai de réalisation trop long. Plusieurs laboratoires ont déjà l’expérience de son utilisation ; – L’ELISA IgM en phase immune de la maladie. Ce test est accessible à tout laboratoire, rapide à réaliser et permet au clinicien d’étayer sa décision pour la prise en charge d’un patient suspecté de leptospirose. Il doit être confirmé par la MAT car ses performances diagnostiques ne sont pas optimales. Le test MAT reste le test de référence utilisable seulement par quelques laboratoires experts, comme par exemple le CNR des Leptospires. Par ailleurs, trois tests évalués n’ont pas leur place dans la stratégie diagnostique actuelle de la leptospirose en France : – La PCR (non en temps réel) qui est une étape de développement technologique aujourd’hui dépassée avec la mise au point de la PCR en temps réel ; – Les tests unitaires à lecture visuelle potentiellement utilisables dans les situations sans autre alternatives mais pour lesquels il ne semble pas y avoir d’expertise en France et qui peuvent être remplacés par le test ELISA IgM ;

52

– Le test TR qui présente des performances diagnostiques insuffisantes, de plus, l’utilisation de ce test a été marqué par une instabilité de certains réactifs et un retrait de lots à l’origine d’une rupture de stocks.

53

1.6 Traitement La réduction de la mortalité au cours de la leptospirose repose sur une anthibiothérapie précoce et la prise en charge urgente des défaillances rénales, respiratoires et cardiovasculaires. 1.6.1 Le traitement antibiotique Le traitement antibiotique doit être prescrit le plus tôt possible, dès que le diagnostic est suspecté et de préférence dans les 5 premiers jours de la maladie, avant que les leptospires ne disséminent dans les tissus (Levett 2001). Au-delà de 5 jours l’intérêt de l’antibiothérapie est plus discutée même si la majorité des cliniciens prescrivent un antibiotique chez un patient symptomatique, quelle que soit la durée d’évolution (WHO 2003). Dans la prise en charge des leptospiroses ictériques, les études historiques comparant l’efficacité de la pénicilline contre placebo ont donné des résultats contradictoires concernant le bénéfice du traitement antibiotique. Malgré cela, l’utilisation des antibiotiques dans le traitement de la leptospirose prouvée ou cliniquement suspectée est universellement recommandée, y compris dans les formes modérément sévères (Levett 2001; Bharti 2003). Les deux classes d’antibiotiques usuellement prescrites dans le traitement de la leptospirose sont les ß-lactamines et les cyclines. À ce jour, aucune résistance clinique à ces antibiotiques n’a été rapportée. Formes non compliquées Dans les formes non compliquées, les traitements recommandés sont l’amoxicilline, l’ampicilline ou la doxycycline par voie orale pendant 7 jours. L’efficacité de la doxycycline a été rapportée dans une étude randomisée en double aveugle contre placebo chez des militaires américains au retour du Panama. Administrée oralement pendant 7 jours, la doxycycline était associée à un raccourcissement de la durée des principaux symptômes (fièvre, céphalées, myalgies) et prévenait l’apparition d’une leptospirurie (McClain 1984). Formes compliquées Dans les formes compliquées on recommande de débuter le traitement par voie intraveineuse, de préférence par une cephalosporine de 3° génération (ceftriaxone, cefotaime), pour une durée de 7 à 10 jours. Les bénéfices de la pénicilline G intraveineuse (6 MU/j)

54

administrée pendant 7 jours, dans le traitement de la leptospirose sévère, ont été rapportés pour la première fois dans une étude randomisée en double aveugle contre placebo réalisée dans les années 1985-1986 aux Philippines (Watt 1988). Dans le groupe traité par pénicilline, les auteurs rapportaient une disparition plus rapide de la fièvre, une amélioration plus rapide de la fonction rénale, une disparition de la leptospirurie et un raccourcissement de la durée d’hospitalisation. Cependant, aucune réduction de la mortalité n’a été rapportée. Bien que l’efficacité clinique de la pénicilline n’ait pas été confirmée dans une autre étude contre placebo réalisée à la même époque et que l’on ne dispose pas d’arguments définitifs sur les bénéfices du traitement, un traitement antibiotique est actuellement recommandé par les différents experts devant toute leptospirose symptomatique (Edwards 1988; Bharti 2003; Vinetz 2003). Même si elles semblent exceptionnelles, des réactions de Jarisch-Herxheimer ont été rapportées et doivent être suspectées en cas de manifestations évocatrices chez un patient traité par pénicilline (Friedland 1991). Comparée à la pénicilline G (6 MU/j), la ceftriaxone (1 g/j) prescrite pendant 7 jours semble aussi efficace pour le traitement des formes sévères. Ses avantages sont l’administration en une seule fois par jour et un spectre d’activité antibactérien plus large, ce qui permet de prendre en compte une éventuelle infection à bacilles à Gram négatif parfois difficile à différencier en début de prise en charge (Panaphut 2003). Dans une autre étude réalisée en Thaïlande, les auteurs ont comparé l’efficacité de la pénicilline G (6 MU/j), le céfotaxime (4 g/j) et la doxycycline (200 mg/j) parentérale pour le traitement des leptospiroses sévères (Suputtamongkol 2004). Les auteurs n’ont pas mis en évidence de différence concernant le taux de mortalité, la durée de la fièvre ou des défaillances d’organes entre les trois traitements. En pratique, il est actuellement recommandé de privilégier les céphalosporines de 3e génération en première intention dans les leptospiroses sévères hospitalisées, afin de traiter un éventuel sepsis à bacilles à Gram négatif qui pourrait avoir une présentation clinique identique. Une fois le diagnostic de leptospirose confirmé, le relais peut ensuite se faire par l’amoxicilline. La durée du traitement est de 7 jours dans toutes les études précédemment citées et aucune étude n’a étudié l’intérêt de prolonger ce traitement.

55

1.6.2 Le traitement des défaillances viscérales Les patients se présentant avec des complications viscérales, qu’elles soient inaugurales ou survenant après plusieurs jours d’évolution, doivent être identifiés sans délai afin d’être pris en charge en unités de soins intensifs et de réanimation (Levett 2001). Comme rapporté au chapitre précédent, le bénéfice de l’antibiothérapie pour ces patients vus le plus souvent tardivement est incertain et la prise en charge précoce des défaillances rénales, pulmonaires et cardiaques est l’élément fondamental pour réduire la mortalité de ces formes sévères (McBride 2005). L’atteinte rénale survenant au cours de la leptospirose est le plus souvent non oligurique et associée à une hypokaliémie. A un stade précoce, le traitement repose sur une compensation des pertes hydro-électrolytiques et est associée à un bon pronostic (Abdulkader 1996). Chez les patients évoluant vers une forme anurique, un recours à l’hémodialyse est indispensable pour passer cette phase critique associée à une forte mortalité (Seguro 1990; Abdulkader 1996; WHO 2003; Andrade 2008). La survenue d’une hémorragie intra-alvéolaire massive est une des complications les plus sévères de la leptospirose et conduit à un syndrome de défaillance respiratoire aigu caractérisé par une faible compliance pulmonaire. Une prise en charge en réanimation est nécessaire et fait appel à une ventilation mécanique « protective » à bas volumes et basses pressions de plateau afin d’éviter les lésions alvéolaires induites par les hautes pressions de ventilation (Amato 1998; Network. 2000). Cette approche thérapeutique améliore le pronostique mais la mortalité liée au SHPS reste élevée même quand un traitement approprié est mis en place. Bien que l’atteinte pulmonaire semble liée à un processus auto-immun, l’utilisation de thérapie immunosuppressive comme les corticoïdes n’a été rapportée que dans des séries non contrôlées et n’est pas actuellement recommandée (McBride 2005; Rodrigo 2014). La prise en charge des autres défaillances d’organe n’est pas spécifique, ainsi la défaillance circulatoire fait appel à l’utilisation d’amines vasoactives, et les complications hémorragiques nécessitent l’administration de transfusion globulaire et de concentrés plaquettaires. Au total, la précocité du diagnostic étiologique et l’identification précoce des patients à risque est un élément fondamental de la prise en charge, afin de débuter précocement une antibiothérapie adaptée mais aussi pour une prise en charge précoce des défaillances viscérales en service de réanimation. 56

1.7 Prévention En l’absence d’un vaccin efficace contre l’ensemble des souches circulantes et disponible dans toutes les régions d’endémies, on dispose aujourd’hui de peu de mesures de prévention efficaces contre la leptospirose. La chimioprophylaxie semble intéressante mais ne concerne qu’une population très restreinte (voyageurs, militaires) lors d’expositions exceptionnelles (Haake 2002). Dans une étude réalisée en Thaïlande après une épidémie, il a été montré que le port de vêtements protecteurs et la présence de plaies cutanées étaient associées respectivement à une diminution et une augmentation du risque d’infection (Phraisuwan 2002).

Malheureusement, le port de vêtements protecteurs est souvent

irréalisable, que ce soit en zone rurale ou dans les bidonvilles du sud. Pour les communautés urbaines exposées essentiellement par la présence de rats, la prévention repose en premier lieu sur l’amélioration des conditions sanitaires (McBride 2005). Cependant, la prévention de la leptospirose rurale semble beaucoup plus inaccessible compte tenu de la diversité du réservoir animal et sauvage, et la multiplicité des sources de transmission environnementales. 1.7.1 Vaccination La vaccination des humains ou des animaux réservoirs à l’origine de la transmission à l’homme devrait être une ligne majeure de prévention mais au regard de la population exposée la couverture vaccinale est minime. L’intérêt du vaccin est limité par plusieurs facteurs : il ne protège que contre le sérogroupe entrant dans la composition vaccinale (pas de protection croisée), l’immunité induite et de courte durée, et il n’est disponible que dans quelques pays. La multiplicité des sérovars pathogènes présents à travers le monde rend l’élaboration d’un vaccin sous-unitaire difficile (Ko 2009). Aux Antilles françaises, les sérogroupes Icterohaemorragiae et Ballum prédominent mais il existe une grande diversité génétique et certains sérovars n’ont pas encore été identifiés (Bourhy). Le vaccin humain contre la leptospirose n’est disponible que dans quelques pays comme la France, la Chine, Cuba, et la Russie (McBride 2005). Les souches utilisées pour la fabrication des vaccins sont habituellement la souche inactivée du sérovar prédominant dans le pays concerné. En France, un vaccin a été initialement développé en 1974 pour les égoutiers de la ville de Paris. Ce vaccin humain monovalent est constitué de L. interrogans sérovar Icterohaemorragiae souche Verdun inactivée par le formaldéhyde et a été commercialisé sous le nom de Spirolept® dans les années 1980 (Mailloux 1982; Mailloux

57

1983). Les indications du vaccin sont détaillées dans le Calendrier Vaccinal, selon l’avis du Haut Conseil de la santé publique (Ministère des Affaires sociales et de la Santé 2013). La vaccination concerne quasi exclusivement le milieu professionnel et elle est proposée par le médecin du travail aux personnes exerçant une activité professionnelle exposant spécifiquement au risque de contact fréquent avec des lieux infestés par les rongeurs (égoutiers, entretiens des canaux, activités spécifiques en eau douce …) mais aussi les personnels des abattoirs et les travailleurs agricoles. Le schéma vaccinal est relativement lourd puisqu’il comporte deux injections à 15 jours d’intervalle, un rappel entre 3 à 6 mois et ensuite tous les 2 ans, si l’exposition persiste. 1.7.2 Prophylaxie médicamenteuse L’efficacité d’une prophylaxie antibiotique par doxycycline en prévention de la leptospirose a été analysée dans 3 études randomisées réalisées au Panama, au Brésil et en Inde (Takafuji 1984; Gonsalez 1998; Sehgal 2000). L’administration hebdomadaire de doxycycline (200 mg/sem) était associée à une diminution du nombre de cas microbiologiquement confirmés dans un groupe de 940 soldats américains participant à un exercice militaire de trois semaines au Panama, mais pas dans une population de résidents d’une zone rurale des îles Andaman suivis pendant une période de 12 semaines (Takafuji 1984; Sehgal 2000). Dans une étude réalisée en post exposition après une inondation à Sao Polo au Brésil, l’administration d’une dose unique de doxycycline ne semblait pas efficace pour réduire le risque de développer une leptospirose (Gonsalez 1998). Dans les régions où coexistent le paludisme et la leptospirose, l’administration quotidienne de doxycycline (100 mg/j) en prévention du paludisme pourrait aussi avoir un effet préventif contre la leptospirose, comme cela a été rapporté chez des participants à un raid sportif à Bornéo (Sejvar 2003). Au total, l’intérêt d’une prophylaxie semble surtout intéressant pour les voyageurs (touristes, militaires) exposés lors d’un séjour de courte durée dans les situations à haut risque (BrettMajor 2009). Dans les suites d’inondations exceptionnelles survenues en 2005 au Guyana, une épidémie de leptospirose a conduit les autorités à mettre en place une campagne de prophylaxie par doxycycline pour plus de 280 000 personnes sur une période de 3 semaines, sans que l’on puisse évaluer l’impact réel de cette campagne (Dechet 2012). Le même type de prophylaxie post exposition (200mg dose unique) a été administré avec une réduction du risque de leptospirose chez des victimes d’une inondation en Thaïlande (Chusri 2014).

58

2. OBJECTIFS DE LA THESE Comme nous l’avons vu précédemment, plusieurs problématiques de santé publique émergent de la pratique clinique: quels sont les facteurs de risques de leptospirose, quels sont les facteurs pronostiques de la maladie, et quelle est l’incidence réelle de la leptospirose aux Antilles. Dans ce travail de thèse nous nous sommes focalisés sur l’épidémiologie de la leptospirose en Martinique et, en utilisant le diagnostic par biologie moléculaire, nous cherchons à répondre à plusieurs questions : -

Quelle est la place des tests diagnostiques comme la PCR en temps réel dans une enquête épidémiologique autour de cas groupés de leptospirose ?

-

Quels facteurs de risque peuvent-ils être identifiés et quelles recommandations de prévention peuvent être données dans ce contexte ?

-

Quels ont les facteurs cliniques et biologiques associés à la sévérité de la maladie ?

-

Quelle sont les tests diagnostiques nécessaires au suivi de l’incidence de la maladie ?

Les objectifs de ce travail sont d’approfondir les connaissances actuelles sur l’épidémiologie de la leptospirose aux Antilles grâce à l’apport du diagnostic par biologie moléculaire dans l’étude des facteurs de risques, de ses facteurs pronostiques et de son incidence.

59

3. RESULTATS 3.1. Article 1 - Outbreak of Leptospirosis after a Race in the Tropical Forest of Martinique Patrick Hochedez, Jacques Rosine, Rafaelle Théodose, Sylvie Abel, Pascale Bourhy, Mathieu Picardeau, Philippe Quénel, and André Cabié. Outbreak of Leptospirosis after a Race in the Tropical Forest of Martinique. Am. J. Trop. Med. Hyg., 84(4), 2011, pp. 621–626. Dans les jours suivant une compétition de course d’endurance en plein air (trail) organisée en Martinique après une période de forte pluviosité, plusieurs cas de leptospirose ont été diagnostiqués chez les participants. L’objectif de cet article était de rapporter les résultats des investigations épidémiologiques réalisées dans les semaines suivant la course, de discuter les éventuels facteurs de risques et de faire des recommandations de santé publique. Parmi les 230 athlètes participants, nous avons réussi à en contacter 148 (64%) et 20 (13.5%) ont été classés en cas suspects, dont cinq ont été hospitalisés. Le diagnostic de leptospirose a été confirmé biologiquement, par PCR ou sérologie, chez 10 des 11 athlètes prélevés et le sérogroupe Pyrogenes était le plus fréquemment identifié. Le seul facteur de risque identifié lors de l’analyse univariée était la présence d’abrasions cutanées, rapportées chez 14 (73.7%) des cas suspects. Cet article rapporte pour la première fois la survenue de cas de leptospirose après un événement sportif aux Antilles et souligne l’intérêt des tests diagnostiques comme la PCR en temps réel pour confirmer précocement le diagnostic et formuler des recommandations de santé publique. Depuis l’investigation menée pour ces cas groupés, les participants à ces compétitions en plein air sont informés régulièrement du risque spécifique de leptospirose et des moyens de prévention, spécialement lors des périodes de pluies inhabituelles ou d’inondations. Contribution personnelle à ce travail : Mise en place de l’enquête épidémiologique, analyse des résultats et écriture de l’article en collaboration avec les co-auteurs.

60

61

62

63

64

65

66

3.2. Article 2 - Outbreak of leptospirosis among canyoning participants, Martinique, 2011 Patrick Hochedez, Martina Escher, Hervé Decoussy, Ludovic Pasgrimaud, Roland Martinez, Jacques Rosine, Rafaelle Théodose, Pascale Bourhy, Mathieu Picardeau, Claude Olive, Martine Ledrans, André Cabié. Outbreak of leptospirosis among canyoning participants, Martinique, 2011. Euro Surveill. 2013;18(18): 20472. Une dizaine de jours après avoir participé à des activités de canyoning, un diagnostic de leptospirose était confirmé par PCR chez 2 participants parmi un groupe de 45 gendarmes. L’objectif de cet article était de rapporter les résultats des investigations épidémiologiques, de discuter les éventuels facteurs de risque et de faire des recommandations de prévention. Tous les participants ont été informés de leur probable exposition à la leptospirose et de la nécessité de consulter rapidement en cas de fièvre. Parmi les 41 répondants au questionnaire qui leur avait été adressé, 8 d’entre eux ont rapportés des symptômes compatibles et ont été traités par antibiotiques durant la première semaine des symptômes. Le diagnostic a été confirmé chez 7 patients par PCR et la même extraction d’ADN a permis secondairement l’identification de 3 espèces génomiques différentes. Compte tenu du faible effectif, aucun des potentiels facteurs de risque étudiés n’a été confirmé. Cet article rapporte pour la première fois la survenue de cas groupés de leptospirose parmi des participants à une activité de canyoning aux Antilles. Ce travail met de nouveau en avant l’intérêt d’une confirmation diagnostique précoce pour informer rapidement l’ensemble des personnes exposées au risque de leptospirose, et débuter le traitement antibiotique précocement, quand il a le plus de chance d’être efficace. Dans les suites de cet évènement, l’ensemble des clubs de canyoning de la Martinique ont été informés du risque spécifique de leptospirose et des moyens de prévention. Contribution personnelle à ce travail : Mise en place de l’enquête épidémiologique, analyse des résultats et écriture de l’article en collaboration avec les co-auteurs.

67

68

69

70

71

72

73

74

75

3.3. Article 3 – Severe leptospirosis is associated with high levels of leptospiremia and Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae in Martinique

Patrick Hochedez, Rafaelle Theodose, Claude Olive, Pascale Bourhy, Guillaume Hurtrel, Nicolas Vignier, Hossein Mehdaoui, Ruddy Valentino, Roland Martinez, Jean-Marie Delord, Cécile Herrmann, Isabelle Lamaury, Raymond Césaire, Eric Caumes, Mathieu Picardeau, André Cabié. [Article soumis à EID le 28/06/2014] Nous avons mis en place une étude de cohorte prospective avec des patients pris en charge pour une leptospirose diagnostiquée par RT-PCR entre 2010 et 2013 en Martinique. L’objectif de notre travail était de déterminer si la leptospirémie et certains paramètres clinico-biologiques mesurés à l’admission étaient associés à la sévérité de la maladie. La sévérité était définie par le décès ou l’utilisation des traitements réanimatoires suivants : ventilation mécanique, dialyse, perfusion de drogues vasoactives ou transfusion sanguine. Parmi les 102 patients inclus dans l’étude, 12 étaient sévères (11,7%) et la leptospirémie déterminée par RT-PCR était significativement plus élevée chez les cas sévères (7.49 log10 (7.13-7.81) vs. 4.16 log10 (3.14-4.93), p= 0.00001). Un seuil critique de 6.5 log10 (leptospires/ml) pouvait être considéré pour les cas sévères. Les Principaux éléments clinicobiologiques relevés à l’admission et associés à la sévérité étaient : l’hypotension, les anomalies auscultatoires, l’ictère, l’oligurie, la thrombopénie, la chute du TP, l’identification de l’espèce Leptospira interrogans, et le sérovar Icterohaemorrhagiae/Copenhageni. Cet article rapporte pour la première fois grâce à une étude de cohorte prospective l’association entre l’élévation de la concentration sanguine de leptospires et la sévérité de maladie aux Antilles. Ce travail nous a aussi permis de déterminer quels critères clinico-biologiques recueillis à l’admission du patient étaient associés à la sévérité et permettent de mieux orienter la prise en charge du patient. Enfin, nous rapportons l’association entre l’espèce Leptospira interrogans sérovar Icterohaemorrhagiae/ Copenhageni et la sévérité de la maladie en Martinique. Contribution personnelle à ce travail : Rédaction du protocole, investigateur principal de l’étude, inclusion et suivi de la majorité des patients, analyse des résultats et écriture de l’article en collaboration avec les co-auteurs. 76

Severe leptospirosis is associated with high levels of leptospiremia and Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae in Martinique Patrick Hochedez, MD1,11, Rafaelle Theodose, MD2,11, Claude Olive, MD2,11, Pascale Bourhy, PhD3, Guillaume Hurtrel, MD1, Nicolas Vignier, MD1,4, Hossein Mehdaoui, MD5, Ruddy Valentino, MD5, Roland Martinez, MD6, Jean-Marie Delord, MD7, Cécile Herrmann, MD8,11, Isabelle Lamaury, MD9,11, Raymond Césaire, MD10,11, Eric Caumes12, MD, Mathieu Picardeau, PhD3, André Cabié, MD1,13 1

Service des Maladies Infectieuses et Tropicales, and 2Service de Bactériologie, Centre

Hospitalier Universitaire de Martinique, Fort de France, Martinique, France; 3Unité de Biologie des Spirochètes, Centre National de Référence et Centre Collaborateur OMS de la Leptospirose, Institut Pasteur, Paris, France; 4Service des Maladies Infectieuses et Tropicales, Centre Hospitalier Universitaire Avicenne, Bobigny, France; 5Service de Réanimation, Centre Hospitalier Universitaire de Martinique, Fort de France, Martinique, France; 6Service de Médecine Polyvalente, Centre Hospitalier de Trinité, Martinique, France;

7

Service de

Médecine Polyvalente, Centre Hospitalier du Lamentin, Martinique, France; 8Service de Bactériologie, and 9 Service des Maladies Infectieuses et Tropicales/Dermatologie-Médecine Interne, Centre Hospitalier Universitaire de Pointe à Pitre, Guadeloupe, France ; 10Service de Virologie, Centre Hospitalier Universitaire de Martinique, Fort de France, Martinique, France;

11

Université des Antilles et de la Guyane EA 4537, France;

12

Service des Maladies

Infectieuses et Tropicales, Centre Hospitalier Universitaire Pitié Salpetrière, Paris France. 13INSERM CIC 1424, France Correspondence to: Patrick Hochedez (corresponding author), Service des Maladies Infectieuses et Tropicales, Centre Hospitalier Universitaire de Martinique, BP 632, 97261 Fort de France, Martinique, France. Tel 33 1 96 55 23 01; Fax 33 1 96 55 97 44; Email: [email protected] Article summary line: Severe leptospirosis in Martinique Keywords :

severe

leptospirosis,

leptospiremia,

Leptospira

interrogans,

serogroup

Icterohaemorrhagiae, qPCR, Martinique

77

Abstract We conducted a cohort study of patients with qPCR-confirmed leptospirosis in Martinique, a Caribbean island where the disease is endemic, in 2010- 2013. Cases were considered severe if vasoactive drugs, dialysis, blood transfusion, or mechanical ventilation was required. Among the 102 patients enrolled, 12 had criteria of severe leptospirosis (11.7%). qPCRdetermined leptospiremia was significantly higher among severe cases (7.49 log10 (7.137.81) vs. 4.16 log10 (3.14-4.93), p=0.00001), and we found a critical threshold of 6.5 log10 (leptospires/ml) that could be considered for severe cases. The clinical, laboratory, and microbiologic findings at the time of admission that were associated with severe leptospirosis included: hypotension, chest auscultation abnormalities, icterus, oligoanuria, platelets < 92 G/ l, prothrombin time < 68%, identification of Leptospira interrogans species (p= 0.001), and serovar Icterohaemorrhagiae/Copenhageni (p=0.03). Quantitative polymerase chain reaction is a rapid diagnostic method in the diagnosis of acute leptospirosis and may provide timely information regarding disease severity. INTRODUCTION Leptospirosis is a bacterial zoonosis of worldwide distribution whose incidence is higher in impoverished populations in developing countries and tropical regions (1). According to the World Health Organisation, it has been estimated that more than one million cases of leptospirosis occur worldwide each year and the disease poses an increasing public health problem (2). Humans are usually infected through contact with water or soil contaminated with the urine of carrier animals, and less frequently through direct contact with animals (3). Leptospirosis cases occur as a result of daily occupational exposure in rural regions and urban slums, but also due to recreational activities, and extreme climatic events such as hurricanes and flooding (2, 4, 5). The disease is caused by pathogenic strains of the genus Leptospira, which is composed of 21 genomic species; 9 of them are identified as pathogenic, and comprising over 200 serovars (6, 7). Clinical manifestations are protean and the spectrum of symptoms range from an influenza-like syndrome to Weil’s disease (the triad of jaundice, acute renal failure, and haemorrhage) and acute respiratory distress syndrome which are associated with mortality rates over 10 to 50%, respectively (5). To reduce the burden of severe leptospirosis, early diagnosis and prompt triage of high-risk patients is critical. Antibiotic treatment is likely to have the greatest benefit during the early acute stage of the illness (preferably before the fifth day), and complications such as acute renal failure, respiratory insufficiency and shock require early treatment and monitoring in Intensive Care 78

Units (5, 8). Culture and serologic based diagnosis, including the microscopic agglutination test (MAT) which is considered to be the gold standard diagnostic test for leptospirosis, are insensitive in the first week of symptoms. At present, only direct detection methods using PCR might provide rapid diagnosis during the acute stage of the illness. Quantitative PCR (qPCR) also offers the ability to measure the level of leptospiremia in clinical samples, a parameter that has been associated with disease severity in three retrospective studies conducted in New Caledonia and Peru (9-11). Finally, DNA extracts from blood samples can also be used for the identification of leptospires at the species and subspecies levels (12). Leptospirosis is endemic in Martinique, a Caribbean island of the French West Indies with 400,000 inhabitants, and its incidence was 37/ 100,000 in 2012, which was 66 times higher than in Mainland France (data from the National Reference Center for Leptospirosis, Institut Pasteur). Our primary objective was to determine if qPCR-determined leptospiremia was associated with severe evolution of the disease in a cohort of laboratory-confirmed cases. Secondary objective was to identify clinical and biological variables associated with severe leptospirosis. METHODS Study design Samples for the present study were obtained from a cohort of patients between December 2010 and February 2013 in the University Hospital of Fort-de-France and two other hospitals (located in La Trinité, and Le Lamentin). Laboratory studies were performed at the University Hospital Fort de France (qPCR and culture), and the National Reference Center (NRC) for Leptospirosis at Institut Pasteur, Paris, France (MAT and genotyping). Inclusion criteria and case definitions Patients were included according to the following criteria: adults (more than 18 years), diagnosis of leptospirosis confirmed by qPCR, acceptance to participate in the study, patient registered in the French social security system. Patients’ characteristics, symptoms, and physical findings were recorded at admission using a standardized questionnaire with an electronic Case Report Form (eCRF). Patients were queried regarding their exposures (e.g. farming, fresh water exposure), host-related factors (e.g. chronic alcoholism, tobacco use), and their contact with animals. A complicated evolution of leptospirosis was defined as the occurrence during the 12-week follow-up period of one or more of the following complications: acute renal failure (serum creatinine > 177 µmol/L), icteric leptospirosis (total 79

bilirubin > 34 µmol/L), pulmonary haemorrhage or other internal bleeding, respiratory distress syndrome, heart failure, multi organ failure.

Among complicated leptospirosis,

severe leptospirosis was defined by the presence of at least one of the following criteria: shock treated with vasoactive drugs, acute renal failure requiring dialysis, internal bleeding requiring blood transfusion, respiratory insufficiency requiring mechanical ventilation, or death. Diagnosis of leptospirosis by qPCR and quantification of Leptospira in Blood Samples After the concentration of 1.8 ml EDTA-treated plasma by centrifugation (12,000g, 10 min), DNA was extracted (QIAamp DNA Mini Kit; Qiagen SA, Courtaboeuf, France) and used to perform a SYBR green assay targeting lfb1 as previously described (13). qPCRs were performed on an iQTM5 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Marnes-laCoquette, France). The sensitivity of the assay was evaluated using DNA extracted from a range of 107-102 leptospires/ml ten-fold dilutions of reference strains belonging to L. borgpetersenii, L. interrogans and L. kirschneri. During the study period, PCR were performed twice a week and quantification was carried out secondarily after the initial screening stage to minimize variability between measurements. All DNA samples were tested twice in independent experiments.

Serologic and culture diagnosis Serum samples were subjected to the microscopic agglutination test (MAT) at the NRC for Leptospirosis at the Institut Pasteur (Paris, France) as previously described (14). For 45 samples available for culture, Leptospira were cultured by inoculating plasma prepared from heparinized blood from patients into Ellinghausen, McCullough, Johnson and Harris (EMJH) liquid medium at the University Hospital Fort de France (Martinique). Leptospires positive cultures were then sent to the NRC for Leptospirosis for typing. Genetic characterization of Leptospira Genomic DNA was extracted from EMJH cultures or from human plasma, then species identification was performed by amplification and sequencing of the 16S rRNA (15,

80

16). Identification at the subspecies level was also performed by sequencing the secY gene and by multiple-locus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) using the loci VNTR4, VNTR7, and VNTR10 as previously described (17). MAT serogrouping was also performed on positive cultures. Data Analysis Statistical analysis was performed using Stata software version 12 (StataCorp LP, College Station, TX, USA). Categorical variables were summarized using frequency and percentage and compared (severe vs. others) using the Fischer-Exact test. Continuous variables were summarized using median, first quartile (Q1) and third quartile (Q3), and compared using non-parametric tests (Mann-Whitney test or Kruskal-Wallis as appropriate). Leptospiremia was log-transformed. Receiver operating characteristics (ROC) curve analysis was used to determine the critical threshold for leptospiremia as the marker for leptospirosis severity. Logistic regression was used to identify factors associated with severe leptospirosis and to estimate odds ratios (ORs) and 95% confidence intervals (CIs). A P value of less than 0·05 was considered statistically significant. Human Subjects Protections The study was approved by the French consultative committee for data processing in health research. Informed consent was obtained from patients. All data analysed were anonymised. RESULTS Between December 2010 and February 2013, 131 patients were diagnosed for leptospirosis by qPCR in the University Hospital of Fort de France (Martinique). Samples were obtained from the University Hospital (n=57), two other hospitals on the island (n=69), and private laboratories (n=5). 29 samples were excluded from further analysis because they were not hospitalized in our centre, and follow-up was not possible (n= 15), could not be traced (n=7), refused follow-up (n=4), or were children (n=3). A total of 102 patients diagnosed for leptospirosis by qPCR were included. The majority of cases were men (86.3%) who originated from Martinique (77.4%), and their 81

median age was 49 [37-57] years. Of these patients, 89 were hospitalized and the remaining 13 were outpatients. The median delay between onset of symptoms and hospitalization was 3 [2-5] days and 23 patients required hospitalizations in ICUs. Among the 102 patients, 48 (47%) had a complicated evolution of leptospirosis, and 12 (11.7%) met our clinical definition for severe leptospirosis. The median length of hospitalization was 14 [8-29] days for severe cases compare to 5.5 [4-8] days for others (p=0.0002). All the patients included in the study were diagnosed by qPCR prior to administration of any antibiotics. The median delay for qPCR diagnosis was 3 [2-5] days, and blood tests were sampled from day 1 to day 11 after the onset of symptoms. All but three patients were given antibiotics, and the median delay between onset of symptoms and antibiotics was 4 [3-5] days. This delay was not significantly different in severe cases. Leptospiremia, which was determined by qPCR (Figure 1) was significantly higher among severe cases (7.49 log10 (7.13-7.81) vs. 4.16 log10 (3.14-4.93), P= 0.00001). Major complications that were present at admission or occurred during the follow-up are reported in Table 1, together with their associated leptospiremia. Among the 12 patients that met our clinical definition for severe leptospirosis: 9 had shock requiring vasoactive drugs, 8 had pulmonary involvement requiring mechanical ventilation, 8 had internal bleeding requiring blood transfusion, and 7 had acute renal failure requiring dialysis. No patient died. The median length of evolution before the occurrence of a severe leptospirosis was 3 [3-4] days. Except for acute renal failure, all complications were associated with a higher level of leptospiremia (Table 1, and figure 2). Using a Roc analysis we found a critical threshold of 6.5 log10 (leptospires/ml) that could be considered for severe leptospirosis (Figure 1). Among epidemiologic characteristics, only the presence of rats in the house or in the surrounding vicinity was associated with severity. Neither occupation, host-related factors, nor contact with other animals were associated with severity. The clinical characteristics at admission and their potential association with severe leptospirosis in the univariate analysis are presented in Table 2. The following clinical signs were associated with severe leptospirosis: hypotension, chest auscultation abnormalities, icterus, and oligoanuria. None of the patients reported previous immunization against leptospirosis. Laboratory findings at the time of admission and their potential association with severe leptospirosis are presented in Table3. These included bilirubin > 49 µmol/L , Creatinine > 154 µmol/L, urea nitrogen > 9.3 mmo/L, CPK > 443 U/L, CRP > 282 mg/L, Hemoglobin < 12.2 g/dL, lymphocytes < 0.49 G/L, platelet < 92 G/L, and prothrombin time < 68%.

82

Molecular typing was performed in genomic DNA from the 102 acute-blood samples (Table 4). Species determination by sequencing the 16S rRNA (rrs) was successful for 85 patients (83%) and the samples corresponded to one of the following 6 pathogenic species: L. interrogans, L. santarosai, L. borgpetersenii, L. kirschneri, L. kmetyi, and L. noguchii. Molecular identification at the subspecies level was successful for 57 patients (56%) by sequencing the secY gene and MLVA. For 22 patients (of 45 tested), culture were positive. Finally, MAT was performed from acute and convalescent serum samples, allowing the identification of the putative serogroups in 70 patients (68.6%). Based on our knowledge of Leptospira circulating agents in Martinique, (12) our data has shown that the most common serogroups identified were Icterohaemorrhagiae (39), Ballum (11), Celledoni (10), Tarassovi (7), and Australis (3). Serogroup Icterohaemorrhagiae can be subdivided into serovars Icterohaemorrhagiae/Copenhageni (20) and Bogvere (10); the remaining (9) cannot be unambiguously typed at the serovar level. The identification of the putative serogroup was not possible for 32 patients because DNA sequences were not interpretable or did not match the genotype of known serovars (see Supplementary Material). To determine whether the success of genomic identification correlated with leptospiremia, we compared median leptospiremia of specimens with and without species identification and found that the latter was significantly lower in the univariate analysis (P= 0.0001, Table 4). On the basis of melting temperature (Tm) variability among the lfb1 amplification products, we observed that L. interrogans strains had a median melting peak at 83.1°C (82.8-83.4) which was significantly different from other species for which the median melting peak was 85°C (84-85.9) (P= 0.0001). Among the genomic species identified, L. interrogans was associated with severity (P=0.001), highest level of leptospiremia (P=0.0001, Table

4),

and

previous

exposure

to

rats

(P= 0.02).

Interestingly,

serovar

Icterohaemorrhagiae/Copenhageni was identified in 11 out of the 12 cases with severe disease showing that this serovar is commonly associated with severe leptospirosis (P=0.03). DISCUSSION This prospective study allowed us to report the potential contribution of molecular based techniques to timely diagnosis and disease severity evaluation of acute leptospirosis at the point-of-care in an endemic area. qPCR-determined leptospiremia > 6.5 log10 (leptospires/ml), identification of the genomic species L. interrogans, and the identification of serovar Icterohaemorrhagiae/Copenhageni were associated with severe leptospirosis. We also 83

identify several clinical and biological variables present at the time of admission that were associated with severe forms of leptospirosis. We classified the severity of leptospirosis based on treatment-related criteria rather than complication-related criteria (e.g. Weil’s syndrome) or the type of hospitalization (e.g. Intensive Care Unit). This classification was preferred in order to reflect everyday patient management, as it was reported in two previous studies in Guadeloupe and New Caledonia (11, 18). Contrary to those two studies for which the case-fatality rate was from 14% to 25%, none of our cases were fatal (11, 18). Since our patients were included early in the course of the disease (when qPCR is positive), absence of fatal cases could be related to combined factors such as the reduced diagnosis time, early antibiotic treatment, early hospitalization within an ICU, or other factors that were not taken into account (e.g. inherent pathogenicity of leptospiral strains). Contrary to previous studies in endemic areas, we did not identify factors such as age, chronic hypertension, chronic alcoholism, smoking, or delay of antibacterial therapy to be associated with severity (4, 11, 18). As previously reported, we identified clinical and laboratory parameters at the time of admission that were associated with severe leptospirosis and could be used to promptly identify at risk patients (4, 11, 18, 19). Noteworthy, patients had their qPCR diagnosis test performed after a median of 3 [25] days after fever onset, while only 8 of our patients had their diagnosis confirmed by MAT on the first serum specimen. As the qPCR assay used can be completed in less than five hours, only direct qPCR allows an unequivocal diagnosis based on a single specimen during the early acute phase of illness – when treatment is likely to have the greatest benefit – and before serological and/or culture results become available (8, 20, 21). Finally, the precocity of diagnosis may provide potential benefits for epidemiologic investigation as we previously reported for two sporting events in Martinique (14, 22). Our results show a strong association between leptospiremia levels and complications and we defined a leptospiremia critical threshold of 6.5 log10 leptospires/ml associated with disease severity. Bacterial load in blood has already been identified as a predictor of disease severity and outcome for other pathogens such as Neisseria meningitidis (23). A critical threshold of 104/ml for the vital prognosis of leptospirosis patients was initially reported in New Caledonia, based on 12 confirmed cases (9). In a retrospective study in Sri Lanka, median bacterial load was lowest in the uncomplicated group, but was not statistically different from other outcome categories, which could possibly be explained by the small number of severe leptospirosis cases in the study (24). In the largest retrospective study published to date, a critical threshold of 103 leptospires/ml associated with disease severity 84

was reported in New Caledonia (11). Differences between critical thresholds may be related to factors such as the variability of virulence among different leptospiral serovars, host factors, qPCR technique, or the timing of sampling. Regardless, our lower limit of detection (100 bacteria/ml) was comparable to those in previous published studies (25). The same samples obtained during acute illness and used for qPCR-based diagnosis were also used for direct Leptospira genomic identification and a genomic species was identified for 85 patients without the need for culture isolation (12). Definitive identification of the infecting serovar still relies on culture as the gold standard, but the technique is challenging and requires several weeks of incubation.

Conversely, identification of the

putative serogroup by MAT can be impeded by the absence of convalescent-phase samples, or paradoxical- and cross-reactions between serogroups (26). As similarly reported by Agompodi et al., molecular typing performance was impaired for samples with the lowest leptospiremia in our study (27). The most common serogroup identified in our study, Icterohaemorrhagiae, was significantly associated with severe leptospirosis, as was the species L. interrogans. Molecular typing was able to identify L. interrogans serovar Icterohaemorrhagiae/Copenhageni as the major cause of severe leptospirosis, but not L. kirschneri serovar Bogvere, which also belongs to the serogroup Icterohaemorrhagiae. Melting curve analysis of the assay targeting lfb1 may provide rapid and useful additional information as it can differentiate between L.interrogans and other pathogenic species (13, 25), but additional PCR-based methods should be developed to specifically detect serovar Icterohaemorrhagiae/Copenhageni from acute-blood samples. Importantly, the presence of rats in the house and surroundings was also associated with disease severity. Two rat species (Rattus rattus and Rattus norvegicus) are common in Caribbean islands, and are usual carriers of L. interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae (28). The potential correlation between disease severity and serogroup Icterohaemorrhagiae has been reported in tropical islands like Hawaii, Guadeloupe and New Caledonia (11, 18, 29). Consistent to those studies, our results emphasize the importance of public health action for rodent control measures. In France, a human vaccine containing only serovar Icterohaemorrhagiae is given to a restricted group of professionals such as those working within sewage-containing environments (30). Immunization should be evaluated in the French West Indies with the objective to reduce the incidence of severe disease among people with frequent rodent exposure. The main limitation of our study was the small number of patients in the severe category. Concordantly, we were not able to assess if high levels of leptospiremia and the 85

identification of L. interrogans were independent factors associated with severe leptospirosis. Moreover, culture isolation of infecting serovars was not performed for all patients. Although we defined the sensitivity of the qPCR using bacterial concentrations from 102 to 107 leptospires/ml, some patients had qPCR-determined leptospiremia higher than this and we cannot confirm that the test is linear at higher concentrations. Nevertheless, using a Roc analysis we found a critical threshold of 6.5 log10 (leptospires/ml) that could be considered for severe leptospirosis, and that threshold was within the range of our 102 - 107 standard curve. Future studies should take place in other populations and other locations, and explore whether high levels of leptospiremia are related to factors such as pathogen’s virulence characteristics, host factors, or infection inoculum at the time of exposure. In conclusion, qPCR is not only a rapid diagnostic method in the diagnosis of acute leptospirosis. It may also provide timely information regarding disease severity evaluation. Cost still restrains the use of molecular-based diagnostic testing in many tropical countries. However, although the genomic identification of Leptospira species requires the expertise of reference centres, the determination of qPCR-determined leptospiremia seems increasingly accessible and should be evaluated in other endemic areas.

Acknowledgments We thank Olivier Verlaeten and Ludovic Jeanneau who introduced the qPCR technique in the University Hospital of Fort de France; Dorothée Haug and the technical staff at the Service de Bactériologie of the University Hospital of Fort-de-France ; Janick Jean-Marie and the staff at the Centre d’Investigation Clinique et d’Epidémiologie Clinique Antilles-Guyane (CIC-EC, INSERM CIE 802); Christopher Pappas for editorial assistance. We thank the French Ministry of Health with the participation of the Groupement Interrégional de Recherche Clinique et d'Innovation Sud-Ouest Outre-Mer (PHRCI 2011) for funding; the Direction de la Recherche Clinique et de innovation (DRCI) of the University Hospital of Fort-de-France, Martinique, France. References 1.

Levett PN. Leptospirosis. Clin Microbiol Rev. 2001 Apr;14(2):296-326. 86

2.

Hartskeerl RA, Collares-Pereira M, Ellis WA. Emergence, control and re-emerging

leptospirosis: dynamics of infection in the changing world. Clin Microbiol Infect. Apr;17(4):494-501. 3.

Bharti AR, Nally JE, Ricaldi JN, Matthias MA, Diaz MM, Lovett MA, et al.

Leptospirosis: a zoonotic disease of global importance. Lancet Infect Dis. 2003 Dec;3(12):757-71. 4.

Ko AI, Galvao Reis M, Ribeiro Dourado CM, Johnson WD, Jr., Riley LW. Urban

epidemic of severe leptospirosis in Brazil. Salvador Leptospirosis Study Group. Lancet. 1999 Sep 4;354(9181):820-5. 5.

McBride AJ, Athanazio DA, Reis MG, Ko AI. Leptospirosis. Curr Opin Infect Dis.

2005 Oct;18(5):376-86. 6.

Cerqueira GM, Picardeau M. A century of Leptospira strain typing. Infect Genet Evol.

2009 Sep;9(5):760-8. 7.

Ko AI, Goarant C, Picardeau M. Leptospira: the dawn of the molecular genetics era

for an emerging zoonotic pathogen. Nat Rev Microbiol. 2009 Oct;7(10):736-47. 8.

Organisation WH. Human leptospirosis: guidance for diagnosis, surveillance and

control. 2003. 9.

Truccolo J, Serais O, Merien F, Perolat P. Following the course of human

leptospirosis: evidence of a critical threshold for the vital prognosis using a quantitative PCR assay. FEMS Microbiol Lett. 2001 Nov 13;204(2):317-21. 10.

Segura ER, Ganoza CA, Campos K, Ricaldi JN, Torres S, Silva H, et al. Clinical

spectrum of pulmonary involvement in leptospirosis in a region of endemicity, with quantification of leptospiral burden. Clin Infect Dis. 2005 Feb 1;40(3):343-51. 11.

Tubiana S, Mikulski M, Becam J, Lacassin F, Lefevre P, Gourinat AC, et al. Risk

factors and predictors of severe leptospirosis in New Caledonia. PLoS Negl Trop Dis. Jan;7(1):e1991. 12.

Bourhy P, Herrmann Storck C, Theodose R, Olive C, Nicolas M, Hochedez P, et al.

Serovar diversity of pathogenic Leptospira circulating in the French West Indies. PLoS Negl Trop Dis. Mar;7(3):e2114. 13.

Merien F, Portnoi D, Bourhy P, Charavay F, Berlioz-Arthaud A, Baranton G. A rapid

and quantitative method for the detection of Leptospira species in human leptospirosis. FEMS Microbiol Lett. 2005 Aug 1;249(1):139-47.

87

14.

Hochedez P, Escher M, Decoussy H, Pasgrimaud L, Martinez R, Rosine J, et al.

Outbreak of leptospirosis among canyoning participants, Martinique, 2011. Euro Surveill.18(18):20472. 15.

Merien F, Amouriaux P, Perolat P, Baranton G, Saint Girons I. Polymerase chain

reaction for detection of Leptospira spp. in clinical samples. J Clin Microbiol. 1992 Sep;30(9):2219-24. 16.

Postic D, Riquelme-Sertour N, Merien F, Perolat P, Baranton G. Interest of partial 16S

rDNA gene sequences to resolve heterogeneities between Leptospira collections: application to L. meyeri. Res Microbiol. 2000 Jun;151(5):333-41. 17.

Bourhy P, Collet L, Clement S, Huerre M, Ave P, Giry C, et al. Isolation and

characterization of new Leptospira genotypes from patients in Mayotte (Indian Ocean). PLoS Negl Trop Dis.4(6):e724. 18.

Herrmann-Storck C, Saint-Louis M, Foucand T, Lamaury I, Deloumeaux J, Baranton

G, et al. Severe leptospirosis in hospitalized patients, Guadeloupe. Emerg Infect Dis. 2010 Feb;16(2):331-4. 19.

Panaphut T, Domrongkitchaiporn S, Thinkamrop B. Prognostic factors of death in

leptospirosis: a prospective cohort study in Khon Kaen, Thailand. Int J Infect Dis. 2002 Mar;6(1):52-9. 20.

Merien F, Baranton G, Perolat P. Comparison of polymerase chain reaction with

microagglutination test and culture for diagnosis of leptospirosis. J Infect Dis. 1995 Jul;172(1):281-5. 21.

Levett PN, Morey RE, Galloway RL, Turner DE, Steigerwalt AG, Mayer LW.

Detection of pathogenic leptospires by real-time quantitative PCR. J Med Microbiol. 2005 Jan;54(Pt 1):45-9. 22.

Hochedez P, Rosine J, Theodose R, Abel S, Bourhy P, Picardeau M, et al. Outbreak of

leptospirosis after a race in the tropical forest of Martinique. Am J Trop Med Hyg. 2011 Apr;84(4):621-6. 23.

Darton T, Guiver M, Naylor S, Jack DL, Kaczmarski EB, Borrow R, et al. Severity of

meningococcal disease associated with genomic bacterial load. Clin Infect Dis. 2009 Mar 1;48(5):587-94. 24.

Agampodi SB, Matthias MA, Moreno AC, Vinetz JM. Utility of quantitative

polymerase chain reaction in leptospirosis diagnosis: association of level of leptospiremia and clinical manifestations in sri lanka. Clin Infect Dis. May;54(9):1249-55.

88

25.

Bourhy P, Bremont S, Zinini F, Giry C, Picardeau M. Comparison of real-time PCR

assays for detection of pathogenic Leptospira spp. in blood and identification of variations in target sequences. J Clin Microbiol. Jun;49(6):2154-60. 26.

Levett PN. Usefulness of serologic analysis as a predictor of the infecting serovar in

patients with severe leptospirosis. Clin Infect Dis. 2003 Feb 15;36(4):447-52. 27.

Agampodi SB, Moreno AC, Vinetz JM, Matthias MA. Utility and Limitations of

Direct Multi-Locus Sequence Typing on qPCR-Positive Blood to Determine Infecting Leptospira Strain. Am J Trop Med Hyg. Dec 3. 28.

Desvars A, Cardinale E, Michault A. Animal leptospirosis in small tropical areas.

Epidemiol Infect. Feb;139(2):167-88. 29.

Katz AR, Ansdell VE, Effler PV, Middleton CR, Sasaki DM. Assessment of the

clinical presentation and treatment of 353 cases of laboratory-confirmed leptospirosis in Hawaii, 1974-1998. Clin Infect Dis. 2001 Dec 1;33(11):1834-41. 30.

Mailloux M, Lambert R, Chenu M. Résultats de la vaccination humaine contre la

leptospirose ictérohémorragique dans

la

région

parisienne.

Bull

AcadNatl

Med.

1982;166:1151-60.

89

Figure 1. Leptospiremia in 102 confirmed cases of qPCR-confirmed leptospirosis and the day of sample since the occurrence of symptoms in Martinique, 2010-2013.

Each dot (triangle, circle or square) represents the leptospiremia of one leptospirosis case at the day when the sample was made. D1: first day of symptom onset. Severe cases are represented in white-coloured figures, non-severe cases are represented in black-coloured figures. Triangle corresponds to Leptospira interrogans species. Circle corresponds to other identified species, and square corresponds to cases without genomic identification. The line represents the threshold for severe diseases determined by Roc curve analysis.

90

Figure 2. Distribution of leptospiremia among 102 qPCR-confirmed cases of leptospirosis, grouped by severity criteria * in Martinique, 2010-2013.

*Criteria that met our clinical definition for severe leptospirosis: shock treated with vasoactive drugs, acute renal failure requiring dialysis, internal bleeding requiring blood transfusion (e.g, alveolar haemorrhage), and respiratory insufficiency requiring mechanical ventilation or death during hospitalization.

91

Table 1. Complications in 102 confirmed cases of leptospirosis and their associated leptospiremia in Martinique, 2010-2013. Complications

Cases

Controls

n (%)

n (%)

Leptospiremia

Leptospiremia

(log10/ml)

(log10/ml)

40 (39%)

62 (61%)

4.88 (3.91-6.86)

4.13 (3.14-4.90)

28 (27%)

74 (73%)

4.77 (3.55-7.28)

4.25 (3.34-5.09)

24 (23%)

78 (77%)

5.55 (4.07-7.49)

4.16 (3.34-4.96)

22 (21%)

80 (79%)

6.10 (4.55-7.50)

4.13 (3.20-4.93)

11 (11%)

91 (89%)

7.50 (3.88-7.82)

4.29 (3.34-5.09)

9 (9%)

93 (91%)

vasoactive drugs *

7.49 (7.15-7.80)

4.21 (3.27-5.05)

Respiratory

8 (8%)

94 (92%)

7.49 (7.28-8)

4.24 (3.27-5.09)

8 (8%)

94 (92%)

7.53 (7.45-8.01)

4.28 (3.27-5.09)

Internal bleeding requiring

8 (8%)

94 (92%)

blood transfusion*

7.68 (7.5-8.02)

4.24 (3.27-5.05)

7 (7%)

95 (93%)

requiring dialysis*

7.56 (7.49-8.21)

4.27 (3.27-5.09)

Altered mental status

4 (4%)

98 (96%)

7.49 (7.06-7.86)

4.29 (3.34-5.19)

Icteric leptospirosis Acute renal failure Multi organ failure Arterial hypotension Internal haemorrhage Shock

treated

with

insufficiency

requiring

mechanical

P value

0.0035 0.09 0.0052 0.0002 0.0023 < 0.0001 < 0.0001

ventilation* Alveolar haemorrhage

Acute

renal

failure

0.0001 < 0.0001 < 0.0001 0.002

*Complications that met our clinical definition for severe leptospirosis

92

Table 2. Clinical characteristics as a function of severity among 102 patients with qPCR confirmed leptospirosis in Martinique, 2010-2013. Characteristics

All cases

Cases with severe

Cases with non-

N=102

disease

severe disease

N=12

N=90

P value

Fever (> 38°C)

88 (86.3)

9 (75)

79 (87.8)

0.364

Hypotension

10 (9.8)

5 (41.7)

5 (5.6)

0.002

12 (11.8)

3 (25)

9 (10)

0.148

7 (6.9)

4 (33.3)

3 (3.3)

0.003

Abdominal pain

30 (29.4)

5 (41.7)

25 (27.8)

0.329

Vomiting

42 (41.2)

5 (41.7)

37 (41.1)

1

Diarrhea

30 (29.4)

3 (25)

27 (30)

1

Icterus

39 (38.2)

9 (75)

30 (33.3)

0.009

Conjunctival

20 (19.61)

1 (8.3)

19 (21.1)

0.45

2 (1.96)

1 (8.3)

1 (1.1)

0.2

6 (5.9)

1 (8.3)

5 (5.6)

0.54

8 (7.84)

5 (41.7)

3 (3.3)

0.0001

SBP < 90 mm Hg Cough Abnormalities

at

chest auscultation

suffusion Consciousness disorders Hemorrhage* Oliguria**

or

anuria *hemoptysis, hematuria, bleeding of the gums, and hematemesis **urinary volume < 500 mL/ day·

93

Table 3. Initial laboratory findings as a function of severity among 102 patients with qPCR confirmed leptospirosis in Martinique, 2010-2013. Initial

laboratory

findings

All cases

Cases with severe

Cases with non-

N=102

disease

severe disease

n/N (%)

N=12

N=90

n/N (%)

n/N (%)

P value

Bilirubin (µmol/ l)

20 (12-49)

56.5 (35.5-103)

18 (12-38)

0.0035

Bilirubin* >49

25/99 (25.2%)

7/12 (58.3%)

18/87 (20.7%)

0.01

Creatinine (µmol/ l)

104 (88-154)

169.5

100 (87-137)

0.0084

19/89 (21.3%)

0.011

(132.5-

217.5) Creat>154 26/101 (25.7%) 7/12 (58.3%) Urea

nitrogen

5.7 (4.2-9.3)

10.1 (8-18.5)

5.5 (4-8.6)

0.0068

21/84 (25%)

4/8 (50%)

17/76 (22.4%)

0.103

CPK (U/l)

170 (70-443)

953 (204-1332)

145 (64-390)

0.0202

CPK>443

19/75 (25.3%)

5/9 (55.6%)

14/66 (21.2%)

0.041

CRP (mg/ l)

188.5 (108-282)

338.5

177.9 (89-265)

0.0017

(mmo/ l) Urea > 9.3

(197.5-

464.5) CRP>282

26/102 (25.5%)

7/12 (58.3%)

19/90 (21.1%)

0.011

Potassium (mmol/ l)

3.7 (3.4-4.1)

3.75 (3.35-4.15)

3.7 (3.3-4.1)

0.8

Sodium (mmo/ l)

134 (132-136)

134 (131.5-135)

134 (132-136)

0.44

AST (U/l)

61.5 (32-102)

73.5 (59-126.5)

57.5 (31-102)

0.19

ALT (U/l)

55 (30-96)

49 (33.5-74.5)

55 (30-99)

0.69

Hemoglobin (g/dl)

13.2 (12.2-14.5)

12.2 (11.6-13)

13.3 (12.4-14.7)

0.027

26/102 (25.5%)

6/12 (50%)

20/90 (22.2%)

0.071

94

Hb < 12.2 Leucocytes (G/l)

8.51 (6.2-10.9)

10.3 (9.1-11.4)

7.8 (6.1-10.5)

0.07

Lymphocytes (G/l)

0.7 (0.49-1)

0.5 (0.2-0.7)

0.7 (0.5-1)

0.043

(n=78) Lympho.<0.49

24/92 (26%)

4/8 (50%)

20/84 (23.8%)

0.19

Platelet count (G/l)

138 (92-183)

70.5 (32.5-115)

141 (99-191)

0.0011

Platelet <92

26/101 (25.7%)

7/12 (58.3%)

19/89 (21.3%)

0.011

74 (68-90.5)

66.5 (56-74.5)

75.5 (69-91)

0.0166

20/76 (26.3%)

7/12 (58.3%)

13/64 (20.3%)

0.011

Prothrombin

time

(%) TP < 68 *Hematological and biochemical variables were categorized into two groups using Q1 or Q3 value as appropriate

95

Table 4. Genomic identification based on 16S rRNA sequencing of PCR products, and the relative leptospiremia in confirmed cases of leptospirosis in Martinique, 2010-2013. Species

All cases

Cases

with

severe

Leptospiremia

N=102

disease

log10/ml

N=12

median (p25-p75)

no (%) L interrogans*

23

11 (48)

6.35 (4.35-7.50)

L santarosai

22

0

4.39 (3.62-4.94)

L borgpetersenii

18

1(6)

4.11 (2.85-5.21)

L. kirschneri

15

0

4.81 (3.90-5.58)

L. kmetyi

4

0

3.26 (2.41-4.02)

L. noguchii

3

0

4.21 (3.27-5.13)

Unidentified**

17

0

2.69 (2.34-3.88)

*Compared with other species, L. interrogans was associated with highest level of leptospiremia (P=0.0001). ** Leptospiremia of specimens without species identification was significantly lower (P=0.0001)

96

4. SYNTHESE ET DISCUSSION La leptospirose est une zoonose de répartition mondiale avec une incidence plus forte dans les régions tropicales comme aux Antilles où les conditions sont favorables à une transmission à l’homme tout au long de l’année, particulièrement pendant les périodes de fortes pluviosités. Les activités extérieures (agriculture, élevage, activités en eau douce) sont favorisées tout au long de l’année du fait du climat chaud, et plus souvent sans protection pour les mêmes raisons. Compte tenu de la diversité du réservoir animal observé en milieu tropical et à la survie prolongée des leptospires dans l’environnement, les circonstances conduisant à un contact direct ou indirect avec des animaux domestiques ou sauvages sont multiples et chacun peut être potentiellement exposé au cours de sa vie. De la pratique clinique émerge plusieurs problématiques de santé publique : quels sont les facteurs de risques de leptospirose, quels sont les facteurs pronostiques de la maladie, et quelle est l’incidence réelle de la leptospirose aux Antilles. L’objectif de ce travail était de contribuer à répondre à ces questions à travers l’utilisation précoce de la biologie moléculaire pour favoriser le diagnostic, l’analyse des facteurs de risque de leptospirose chez des sportifs exposés en milieu tropical et l’analyse des facteurs de risque de forme sévère dans une cohorte de patients diagnostiqués par RT-PCR.

4.1 Apports du diagnostic par biologie moléculaire dans l’étude des facteurs de risques La survenue de cas groupés de leptospirose après une compétition de trail et après des exercice de canyoning, les 2 évènements s’étant déroulés après des périodes de pluies inhabituelles, nous a permis de rapporter pour la première fois aux Antilles ce type de contamination lors d’activités de loisir et d’identifier la présence d’abrasions cutanées comme facteur de risque de l’infection (QS Illustration des sites de trail et de canyoning en ANNEXE 7.2). Le recours au diagnostic par RT-PCR a permis dans les 2 cas de confirmer rapidement le diagnostic de leptospirose, d’informer l’ensemble des participants de leur exposition potentielle et de la conduite à tenir en cas de fièvre, et de mettre en place une enquête épidémiologique. La connaissance rapide du diagnostic, en particulier chez les pratiquants de canyoning, a aussi conduit à la prescription très précoce d’antibiotique pour les cas confirmés et les cas symptomatiques en attente de confirmation diagnostique. Ces travaux 97

nous ont conduit à promouvoir l’information systématique des participants à ces compétitions en plein air sur le risque de leptospirose et les moyens de prévention (protection vestimentaire en particulier), spécialement après des périodes de pluies inhabituelles ou d’inondations. Cette information est depuis donnée régulièrement avant les grands regroupements sportifs, sous la responsabilité de l’Agence Régionale de Santé et des flyers sont distribués individuellement à l’occasion de la remise des dossards (QS Fiches d’informations destinées aux pratiquants des sports à risque de leptospirose en ANNEXE 7.3). L’engouement croissant pour les loisirs aquatiques et les compétitions sportives en milieu tropical, qui s’accompagnent de regroupement important de participants, créent des conditions favorables à la contamination par les leptospires. Des cas groupés ont ainsi été rapportés, essentiellement en région tropicale, après la pratique de loisirs aquatiques comme la natation, le rafting ou les raids multisport (CDC 1997; Morgan 2002; Sejvar 2003; Stern 2010). Suite à ces évènements, le principal facteur de risque identifié était l’ingestion d’eau d’un lac ou d’une rivière (Morgan 2002; Sejvar 2003; Stern 2010). En dehors du contexte sportif, l’ingestion d’eau d’un puits contaminé ou la présence de plaies cutanées chez les personnes ayant nettoyé un étang ont été identifiés comme des facteurs de risque de contamination dans des épidémies en Italie, à Okinawa et en Thaïlande (Cacciapuoti 1987; Corwin 1990; Phraisuwan 2002). Pour les cas survenus après la course dans la forêt martiniquaise, il semble que la présence d’abrasions cutanée ait facilité la pénétration des leptospires lors de contact avec la boue ou les nombreuses rivières traversées. Pour les cas survenus après le canyoning, l’inoculation a pu survenir par voie muqueuse à l’occasion d’ingestion accidentelle d’eau de rivière ou par voie cutanée à l’occasion d’abrasions cutanées. Malgré plusieurs tentatives, nous n’avons pas réussi à mettre en évidence de leptospires dans l’eau de rivière. La mise en évidence des leptospires dans les eaux de surface grâce à des techniques de RT-PCR a été rapporté dans des environnements divers comme des marais de la région lyonnaise, des caniveaux et flaques d’eau en Amazonie, ou plus récemment dans des barrages d’eau et sources de montagne sur l’île de St Kits dans la Caraïbe (Ganoza 2006; Vein 2012; Rawlins 2014). A ce jour, les enquêtes environnementales (PCR ou culture) ont échoué dans les suites de compétitions sportives américaines marquées par des cas groupés de leptospirose (Morgan 2002; Stern 2010). Ces échecs peuvent être liés à l’absence de bactérie au moment du prélèvement, à leur présence en dessous du seuil de détection, ou à la présence d’inhibiteurs dans l’eau recueillie.

98

4.2 Apports du diagnostic par biologie moléculaire dans l’étude des facteurs pronostiques La mise en place de cette étude de cohorte prospective nous a permis de montrer l’intérêt potentiel de ces techniques de biologie moléculaire pour obtenir un diagnostic précoce et une évaluation de la sévérité à la phase aigüe de la maladie en milieu de soins dans une région d’endémie. Nos critères de définition de la sévérité basés sur le type de traitement plutôt que sur le type de complications ou d’hospitalisation avait pour but de refléter la prise en charge habituelle des patients comme cela avait été rapporté dans 2 études récentes en Guadeloupe et en Nouvelle Calédonie (Herrmann-Storck 2010; Tubiana 2013). L’absence de décès dans notre étude peut résulter de plusieurs facteurs combinés : un diagnostic et un traitement antibiotique précoce par rapport au début de la maladie, une prise en charge rapide en réanimation, ou d’autres facteurs non pris en considération comme la pathogénicité propre des souches infectantes ou les facteurs d’hôte. Dans notre étude, nous avons montré une association forte entre le niveau de leptospirémie et la sévérité et défini qu’un seuil critique de 6.5 log10 (leptospires/ml) pouvait être considéré pour la sévérité de la maladie en Martinique. Le lien entre leptospirémie élevée et gravité a été pour la première fois rapportée par Mérien en Nouvelle Calédonie sur une série de 12 patients (Merien 2005). Dans une étude réalisée au Pérou chez 7 patients présentant une atteinte pulmonaire sévère au cours de la leptospirose, les auteurs ont mis en évidence une leptospirémie supérieure à 104/ml de sang ou par milligramme de tissu (à l’autopsie) (Segura 2005). Dans une autre étude rétrospective réalisée au Sri Lanka, les leptospirémies étaient plus basses chez les patients non compliquées mais sans différence significative, probablement du fait du faible effectif des formes réellement sévères (Agampodi). Enfin, dans une étude rétrospective en Nouvelle Calédonie sur 176 cas, l’association entre leptospirémie élevée et sévérité était rapportée et un seuil de 103 leptospires/ml était associé à la sévérité (Tubiana 2013). Nos différences de seuils critiques pourraient s’expliquer par des différences dans les sérovars, des facteurs d’hôtes, des différences de technique ou de timing de prélèvement. Les résultats nous permettent aussi de rapporter l’association entre l’éspèce Leptospira interrogans sérovar Icterohaemorrhagiae/Copenhageni et la sévérité de la maladie en Martinique. Il est notable de préciser que dans notre étude l’identification génomique a été fait plus souvent à partir des prélèvements utilisés pour la RT-PCR sans recours systématique à la

99

culture, technique de référence mais qui est longue et difficile. Contrairement à la détermination de la leptospirémie, l’identification génomique nécessite des étapes supplémentaires (envoi des extraits au CNR) et ne peut être utilisée pour évaluer la sévérité en pratique courante. Cependant, comme cela a été rapporté dans notre travail et dans d’autres publications, l’analyse de la courbe de fusion de la PCR (Figure 17) permet de distinguer l’espèce L. interrogans des autres espèces et la détermination de la température de fusion (Tm) pourrait donc donner des informations en temps réel sur la souche infectante et son caractère pathogène potentiel (Merien 2005; Bourhy 2011). Dans cette étude le sérogroupe Icterohaemorrhagiae, le sérovar Icterohaemorrhagiae /Copenhageni, et la présence de rats au domicile (hôtes habituels de ce sérogroupe) étaient significativement associés à la gravité. L’association entre la sévérité et le sérogroupe Icterohaemorrhagiae, déjà rapportée sur d’autres îles tropicales, confirme l’importance des mesures de contrôle des populations de rongeurs (Katz 2002; Herrmann-Storck 2010; Tubiana 2013). Par ailleurs, le vaccin disponible en France (qui contient uniquement le sérovar Icterohaemorrhagiae), actuellement utilisé en milieu professionnel, devrait être évalué plus largement chez les personnes exposées régulièrement aux rongeurs en zone d’endémie. Le nombre relativement faible de patients sévères dans notre étude ne nous a pas permis de déterminer si le haut niveau de leptospirémie et l’indentification de L. interrogans étaient des facteurs indépendants associés à la gravité. La physiopathologie de la leptospirose n’est que partiellement comprise et nos résultats s’ajoutent à un tableau complexe. Des études ultérieures, réalisées dans d’autres populations et d’autres régions, devraient explorer si les hauts niveau de leptospirémie sont liés à des facteurs comme la virulence de la souche, l’inoculum au moment de l’exposition, ou bien des liés à l’hôte. Ce travail nous a aussi permis de déterminer quels critères cliniques et biologiques recueillis à l’admission du patient étaient associés à la sévérité. Nous avons identifié 4 critères cliniques de gravité qui peuvent être utilisés dès l’admission pour mieux orienter la prise en charge d’un patient chez qui une leptospirose est suspectée ou confirmée: l’hypotension, les anomalies auscultatoires, l’ictère, l’oligo- anurie. Les différents critères biologiques identifiés peuvent servir à conforter l’évaluation initiale de la gravité. Il est fondamental de dépister tôt ces critères cliniques de gravité car la mortalité au cours de la leptospirose est surtout liée au type d’atteinte viscérale (en particulier les atteintes rénales et pulmonaires) et donc à la précocité d’une prise en charge réanimatoire spécifique (Panaphut 2002; Tantitanawat 2003; Paganin 2007; Spichler 2008; Herrmann-Storck 2010).

100

4.3 Apports du diagnostic par biologie moléculaire dans l’étude de l’incidence L’utilisation du diagnostic par biologie moléculaire contribue à une meilleure estimation de l’incidence de la leptospirose aux Antilles. La leptospirose n’est pas une maladie à déclaration obligatoire en France et les données sur l’incidence de la leptospirose en métropole comme dans les Départements d’Outre-Mer sont mise à jour par le CNR de la leptospirose à Pasteur (CNRL) et reposent essentiellement sur les résultats des sérologies (MAT) et les identifications des cultures adressées par les laboratoires publics et privés. La sous-estimation du nombre de cas est largement dépendante des difficultés diagnostiques et de l’absence d’un système de surveillance épidémiologique adapté. Concernant l’Outre-Mer, la Nouvelle Calédonie est une exception puisque la leptospirose est une maladie à déclaration obligatoire. En 2011, une étude d’incidence a été mise en place par la CIRE Antilles-Guyane et l’INVS, en coopération avec le CNRL afin d’établir une estimation plus exacte de l’importance de l’endémie aux Antilles et apporter des arguments scientifiques pour faciliter l’inscription à la nomenclature des actes de biologie médicale les différents examens nécessaires au diagnostic de la leptospirose (Cassadou 2013). Pour la période 2002-2008, l’incidence en Martinique et en Guadeloupe était de 13,9 et 22,5 respectivement (taux annuel moyen/100 000 habitants) contre 0,47 en métropole. Pour l’année 2011, en cumulant les données de source hospitalière et ambulatoire, l’incidence était estimée à près de 61 cas pour 100 000 habitants en Martinique et 70 cas pour 100 000 habitants en Guadeloupe ; soit une incidence trois à quatre fois supérieure, conduisant à un écart d’autant plus important avec l’incidence observée en métropole sur la période de référence (Cassadou 2013). Pour la Martinique, la PCR en temps réel était le test ayant permis la confirmation des cas dans 80% et on notait qu’un deuxième prélèvement était peu réalisé. En dehors des possibles variations annuelles d’incidence liées aux conditions météorologiques (forte pluviosité en 2011), ces résultats montrent que le recours au diagnostic par biologie moléculaire et par ELISA IgM, permet d’objectiver un nombre de cas très supérieur à celui comptabilisé antérieurement, sans le recours à ces tests. Il est difficile de mettre les résultats de cette étude en perspective avec les données d’autres îles tropicales où les cas ambulatoires ne sont pas toujours comptabilisés

101

et où le diagnostic par PCR n’est pas utilisé. Ainsi à Hawaii sur la période 1999-2008, la moyenne des incidences annuelles n’était que de 1,63 pour 100 000 habitants, mais la confirmation d’un cas nécessitait 2 sérologies et la PCR n’était pas utilisée pour le diagnostic (Katz 2011). A contrario en Nouvelle Calédonie, territoire pionnier pour la mise au point et l’utilisation du diagnostic par PCR, et où la maladie est à déclaration obligatoire, l’incidence rapportée par l’Institut Pasteur était de 23 cas/100 000 en 2013 (Picardeau 2013). Finalement, les résultats de l’étude d’incidence de la leptospirose aux Antilles, qui soulignent l’apport du diagnostic par RT-PCR dans une meilleure évaluation de l’incidence, sont en accord les recommandations publiées par l’HAS en juin 2011. En effet, on peut y lire que la PCR en temps réel et le test ELISA IgM (cette dernière doit être confirmé par la MAT) trouvent leur place dans la stratégie diagnostique de la leptospirose, respectivement pour la première semaine de la maladie et à la phase immune (HAS 2011). Suite à la publication au Journal Officiel du 14 aout 2014, le Ministère des Affaires Sociales et de la Santé à décider de modifier la liste des actes et prestations pris en charge par l’assurance maladie pour le diagnostic de la leptospirose. Il est ainsi noté que la détection de l’ADN du genre Leptospira par amplification génique en temps réel dans le sang sera privilégiée dans les dix premiers jours (B100) et qu’en cas d’amplification génique en temps réel non disponible, négative ou non adaptée à la période, il convient d’entreprendre une recherche sérologique à partir du septième jour environ (Recherche des IgM de Leptospira par EIA ; B40).

102

5. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES La leptospirose est une préoccupation majeure de santé publique en raison de sa distribution mondiale, de son poids sur la santé humaine et animale en zone rurale, du risque d’épidémies, des taux de mortalité potentiellement élevés sans traitement, et de son émergence chez les populations les plus défavorisées des zones urbaines. Le réchauffement climatique et l’apparition plus fréquente de phénomènes climatiques extrêmes comme les inondations, devrait encore aggraver dans l’avenir l’impact de cette pathologie chez les personnes les plus vulnérables. A côté des expositions rurales et urbaines, l’engouement pour les loisirs en eau douce exposent un nombre croissant de pratiquant au risque de contamination lors de leur pratique sportive. Pour mettre au point des mesures de santé publique efficace, il est nécessaire de connaître l’incidence de la maladie et de disposer d’outils diagnostics fiables afin de proposer des traitements effectifs et une prévention adaptée à chaque zone géographique. Comme on l’a vu dans nos travaux, la PCR quantitative est une méthode de diagnostic rapide utilisable en pratique courante en zone d’endémie de leptospirose, et qui permet aussi de donner des informations sur l’évaluation de la gravité. A ce jour, seul le recours à la PCR permet un diagnostic de certitude sur un seul prélèvement, à la phase aigüe de la maladie, quand le traitement antibiotique a le plus de chance d’être efficace, et avant que les résultats des sérologies ou de la culture soient disponibles. Si l’identification génomique requiert des centres d’expertises, les méthodes diagnostiques par biologie moléculaire deviennent plus accessibles comme en témoigne les publications toujours plus nombreuses dans les pays tropicaux. L’utilisation du diagnostic par biologie moléculaire nous a permis de contribuer à l’étude des facteurs de risque et des facteurs pronostiques, mais aussi à mieux connaître le poids réel de la maladie aux Antilles. Notre travail a conduit à promouvoir l’information systématique des participants à ces compétitions en plein air sur le risque de leptospirose et les moyens de prévention, spécialement après des périodes de pluies inhabituelles ou d’inondations. En pratique clinique, la mortalité au cours de la leptospirose étant directement liée au type d’atteinte viscérale et à la précocité du traitement, l’identification de critères de gravité clinico-biologiques présents à l’admission peut être utilisée pour raccourcir le délai de prise en charge dans les services de réanimation.

103

Dans la continuité de l’étude de cohorte visant à identifier les facteurs clinique et biologiques associés à la gravité, nous avons mis au point un protocole de recherche clinique intitulé « Etude de la cinétique de décroissance de la leptospirémie au cours du traitement antibiotique de la leptospirose en Martinique » (acronyme Ciné Lepto), qui a obtenu le financement de l’Appel à Projet Interrégional DOMien 2013 (QS résumé du protocole de recherche clinique CinéLepto en ANNEXE 7.3). L’objectif principal de l’étude est d’étudier l’évolution de la concentration des leptospires dans le sang chez des patients diagnostiqués par PCR dans les premiers jours de la maladie et traités par antibiotique. L’objectif secondaire est d’identifier les facteurs associés à la persistance d’une leptospirémie détectable après une semaine de traitement. Ce protocole de recherche clinique pourrait contribuer à la réflexion sur le raccourcissement des durées de traitement. Si les résultats de l’étude montrent une décroissance rapide des leptospires dans le sang sous antibiotique, cela appuierait la mise en place d’un essai comparant une durée habituelle de 7 jours à une durée plus courte qui pourrait être 3 jours (durée nécessaire pour récupérer les résultats des bilans microbiologiques). Dans le cadre de l’étude intitulée « Étude de la valeur pronostique de la leptospirémie quantitative déterminée par PCR en temps réel au cours de la leptospirose aux Antilles » (QS résumé du protocole de recherche clinique LEPTO en ANNEXE 7.1), nous avons réalisé une collection d’échantillons biologiques afin de réaliser des études complémentaires sur la susceptibilité individuelle à l’infection (polymorphismes génétiques, génotypage HLA…) comme cela a été suggéré dans plusieurs études (Lingappa 2004; Fialho 2009). Compte tenu de la complexité des techniques utilisées et la nécessité d’avoir un grand d’échantillon pour détecter un marqueur de susceptibilité, nous avons décidé de ne pas exploiter cette collection pour l’instant de la poursuivre dans le cadre des inclusions de l’étude CinéLepto. La collection sera idéalement utilisée dans le cadre d’une étude comparant différents marqueurs de susceptibilité potentiels chez nos patients comparés à des témoins.

Un des objectifs de

l’étude d’incidence réalisée en 2011 était de s’inscrire dans la perspective de la mise en place d’un système intégré articulant surveillance, alerte et gestion à l’image du dispositif existant pour la dengue aux Antilles et en Guyane. Le but étant de détecter d’éventuels foyers de la maladie ou des recrudescences saisonnières pouvant conduire à des actions ciblées des ARS (zones à éviter, dératisation), et à faciliter l’information des praticiens pour prendre en compte les différents niveaux de risque (saisonnier, géographique). Les outils de diagnostics ont été mis en place chez l’homme et pourront contribuer à la surveillance de la maladie humaine mais il reste à mettre en place une surveillance animale et environnementale. Nous souhaitons 104

poursuivre la mise au point des techniques de recherche de leptospires dans l’environnement afin d’être capable d’identifier la source d’une contamination lors d’une enquête épidémiologique. Enfin, les sites les plus fréquentés pour des activités de loisir en eau douce (rivière, bassins), pourraient faire l’objet d’une surveillance régulière conduisant à autoriser ou non la pratique des sports aquatiques en fonction du niveau de contamination des eaux de surfaces.

105

6. ARTICLES ET POSTERS ECRITS PENDANT LA THESE 6.1 Publications liées au travail de thèse sur la leptospirose 6.1.1 Articles -

Outbreak of leptospirosis after a race in the tropical forest of Martinique. Hochedez P, Rosine J, Théodose R, Abel S, Bourhy P, Picardeau M, Quénel P, Cabié A. Am J Trop Med Hyg. 2011 Apr;84(4):621-6.

-

Outbreak

of

leptospirosis

among

canyoning

participants,

Martinique,

2011. Hochedez P, Escher M, Decoussy H, Pasgrimaud L, Martinez R, Rosine J, Théodose R, Bourhy P, Picardeau M, Olive C, Ledrans M, Cabie A. Euro Surveill. 2013 May 2;18(18):20472. -

Serovar diversity of pathogenic Leptospira circulating in the French West Indies. Bourhy P, Herrmann Storck C, Theodose R, Olive C, Nicolas M, Hochedez P, Lamaury I, Zinini , Brémont S, Landier A, Cassadou S, Rosine J, Picardeau M. PLoS Negl Trop Dis. 2013;7(3):e2114.

-

Severe leptospirosis is associated with high levels of leptospiremia and Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae in Martinique. Patrick Hochedez, Rafaelle Theodose, Claude Olive, Pascale Bourhy, Guillaume Hurtrel, Nicolas Vignier, Hossein Mehdaoui, Ruddy Valentino, Roland Martinez, Jean-Marie Delord, , Cécile Herrmann, Isabelle Lamaury, Raymond Césaire, Mathieu Picardeau, André Cabié. [Manuscrit soumis au journal Emerging Infectious Diseases le 28/06/2014]

6.1.2 Posters présentés en congrès -

Cas groupés de Leptospirose après un raid sportif aux Antilles. Journées Nationales d’Infectiologie- Montpellier 2011.

-

Cas groupés de Leptospirose après la pratique de canyoning en Martinique. Intérêt du diagnostic par PCR. Journées Nationales d’Infectiologie- Tours 2012.

106

6.1.3 Rapport d’évaluation technologique. Diagnostic biologique de la leptospirose -

Participation comme expert au groupe de travail à distance sur le diagnostic biologique de la leptospirose. Haute Autorité de Santé – Juin 2011.

6.1.4 Etude sur l’incidence de la leptospirose aux Antilles -

Institut de Veille Sanitaire - Incidence de la leptospirose aux Antilles. Etude du 1er janvier au 31 décembre 2011. Participation à l’étude comme référent clinicien en Martinique (Cassadou 2013).

6.1.5 Chapitres de livres -

Chapitre « Leptospirose » du livre Médecine Tropicale - 6° édition (M. Gentilini et coll.). Médecine Sciences – Publications. Editions Lavoisier, Paris, 2012.

-

Chapitre « Leptospirose » de l’EMC : P. Bourhy, P. Hochedez, M. Picardeau. Leptospirose. EMC - Maladies infectieuses 2012;9(1):1-12

6.2 Publications non liées au travail de thèse -

Clinical and microbiologic characteristics of children treated at the Fort de France university hospital after the 2010 Haiti earthquake. Arquès I, Vincent M, Olive C, Cabié A, Canivet I, Hochedez P. Pediatr Infect Dis J. 2013 May;32(5):568-9

-

Human infection with Shewanella putrefaciens and S. algae: report of 16 cases in Martinique and review of the literature. Vignier N, Barreau M, Olive C, Baubion E, Théodose R, Hochedez P, Cabié A. Am J Trop Med Hyg. 2013 Jul;89(1):151-6

107

7. BIBLIOGRAPHIE Abdulkader, R. C., E. F. Daher, et al. (2002). "Leptospirosis severity may be associated with the intensity of humoral immune response." Rev Inst Med Trop Sao Paulo 44(2): 7983. Abdulkader, R. C., A. C. Seguro, et al. (1996). "Peculiar electrolytic and hormonal abnormalities in acute renal failure due to leptospirosis." Am J Trop Med Hyg 54(1): 1-6. Abela-Ridder, B., R. Sikkema, et al. (2010). "Estimating the burden of human leptospirosis." Int J Antimicrob Agents 36 Suppl 1: S5-7. Agampodi, S. B., A. C. Moreno, et al. (2012). "Utility and Limitations of Direct Multi-Locus Sequence Typing on qPCR-Positive Blood to Determine Infecting Leptospira Strain." Am J Trop Med Hyg. Ahmed, N., S. M. Devi, et al. (2006). "Multilocus sequence typing method for identification and genotypic classification of pathogenic Leptospira species." Ann Clin Microbiol Antimicrob 5: 28. Amato, M. B., C. S. Barbas, et al. (1998). "Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome." N Engl J Med 338(6): 347-54. Andrade, L., E. de Francesco Daher, et al. (2008). "Leptospiral nephropathy." Semin Nephrol 28(4): 383-94. Antoniadis, A., S. Alexiou-Daniel, et al. (1995). "Comparison of the clinical and serologic diagnosis of haemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) and leptospirosis." Eur J Epidemiol 11(1): 91-2. Ashford, D. A., R. M. Kaiser, et al. (2000). "Asymptomatic infection and risk factors for leptospirosis in Nicaragua." Am J Trop Med Hyg 63(5-6): 249-54. Baranton, G. and D. Postic (2006). "Trends in leptospirosis epidemiology in France. Sixty-six years of passive serological surveillance from 1920 to 2003." Int J Infect Dis 10(2): 162-70. Bharti, A. R., J. E. Nally, et al. (2003). "Leptospirosis: a zoonotic disease of global importance." Lancet Infect Dis 3(12): 757-71. Bourhy, P., S. Bremont, et al. (2011). "Comparison of real-time PCR assays for detection of pathogenic Leptospira spp. in blood and identification of variations in target sequences." J Clin Microbiol 49(6): 2154-60. Bourhy, P., L. Collet, et al. (2014). "Leptospira mayottensis sp. nov., a pathogenic Leptospira species isolated from humans." Int J Syst Evol Microbiol. Bourhy, P., C. Herrmann Storck, et al. (2013). "Serovar diversity of pathogenic Leptospira circulating in the French West Indies." PLoS Negl Trop Dis 7(3): e2114. Bourhy, P., P. Hochedez, et al. (2012). "Leptospirose." Encyclopédie Médico Chirurgicale 9(1): 1-12. Bovet, P., C. Yersin, et al. (1999). "Factors associated with clinical leptospirosis: a population-based case-control study in the Seychelles (Indian Ocean)." Int J Epidemiol 28(3): 583-90. Brett-Major, D. M. and R. J. Lipnick (2009). "Antibiotic prophylaxis for leptospirosis." Cochrane Database Syst Rev(3): CD007342. Bulach, D. M., R. L. Zuerner, et al. (2006). "Genome reduction in Leptospira borgpetersenii reflects limited transmission potential." Proc Natl Acad Sci U S A 103(39): 14560-5. Cacciapuoti, B., L. Ciceroni, et al. (1987). "A waterborne outbreak of leptospirosis." Am J Epidemiol 126(3): 535-45. 108

Cassadou, S., J. Rosine, et al. (2013). "Incidence de la leptospirose aux Antilles. Etude du 1er janvier au 31 décembre 2011.". CDC (1997). "From the Centers for Disease Control and Prevention. Outbreak of leptospirosis among white-water rafters--Costa Rica, 1996." JAMA 278(10): 808-9. Cerqueira, G. M. and M. Picardeau (2009). "A century of Leptospira strain typing." Infect Genet Evol 9(5): 760-8. Chusri, S., E. B. McNeil, et al. (2014). "Single dosage of doxycycline for prophylaxis against leptospiral infection and leptospirosis during urban flooding in southern Thailand: A non-randomized controlled trial." J Infect Chemother. Corwin, A., A. Ryan, et al. (1990). "A waterborne outbreak of leptospirosis among United States military personnel in Okinawa, Japan." Int J Epidemiol 19(3): 743-8. Coursin, D. B., S. J. Updike, et al. (2000). "Massive rhabdomyolysis and multiple organ dysfunction syndrome caused by leptospirosis." Intensive Care Med 26(6): 808-12. Cullen, P. A., D. A. Haake, et al. (2003). "LipL21 is a novel surface-exposed lipoprotein of pathogenic Leptospira species." Infect Immun 71(5): 2414-21. Cumberland, P., C. O. Everard, et al. (2001). "Persistence of anti-leptospiral IgM, IgG and agglutinating antibodies in patients presenting with acute febrile illness in Barbados 1979-1989." Eur J Epidemiol 17(7): 601-8. Daher, E., D. M. Zanetta, et al. (1999). "Risk factors for death and changing patterns in leptospirosis acute renal failure." Am J Trop Med Hyg 61(4): 630-4. de Brito, T., C. F. Morais, et al. (1987). "Cardiovascular involvement in human and experimental leptospirosis: pathologic findings and immunohistochemical detection of leptospiral antigen." Ann Trop Med Parasitol 81(3): 207-14. de la Pena-Moctezuma, A., D. M. Bulach, et al. (1999). "Comparative analysis of the LPS biosynthetic loci of the genetic subtypes of serovar Hardjo: Leptospira interrogans subtype Hardjoprajitno and Leptospira borgpetersenii subtype Hardjobovis." FEMS Microbiol Lett 177(2): 319-26. de Vries, S. G., B. J. Visser, et al. (2014). "Leptospirosis in Sub-Saharan Africa: a systematic review." Int J Infect Dis 28C: 47-64. Dechet, A. M., M. Parsons, et al. (2012). "Leptospirosis outbreak following severe flooding: a rapid assessment and mass prophylaxis campaign; Guyana, January-February 2005." PLoS One 7(7): e39672. Desvars, A., E. Cardinale, et al. (2010). "Animal leptospirosis in small tropical areas." Epidemiol Infect 139(2): 167-88. Desvars, A., S. Jego, et al. (2011). "Seasonality of human leptospirosis in Reunion Island (Indian Ocean) and its association with meteorological data." PLoS ONE 6(5): e20377. Dupont, H., D. Dupont-Perdrizet, et al. (1997). "Leptospirosis: prognostic factors associated with mortality." Clin Infect Dis 25(3): 720-4. Edwards, C. N., G. D. Nicholson, et al. (1986). "Thrombocytopenia in leptospirosis: the absence of evidence for disseminated intravascular coagulation." Am J Trop Med Hyg 35(2): 352-4. Edwards, C. N., G. D. Nicholson, et al. (1988). "Penicillin therapy in icteric leptospirosis." Am J Trop Med Hyg 39(4): 388-90. Ellinghausen, H. C., Jr. and W. G. McCullough (1965). "Nutrition of Leptospira Pomona and Growth of 13 Other Serotypes: Fractionation of Oleic Albumin Complex and a Medium of Bovine Albumin and Polysorbate 80." Am J Vet Res 26: 45-51. Esen, S., M. Sunbul, et al. (2004). "Impact of clinical and laboratory findings on prognosis in leptospirosis." Swiss Med Wkly 134(23-24): 347-52.

109

Everard, C. O., C. N. Edwards, et al. (1984). "The prevalence of severe leptospirosis among humans on Barbados." Trans R Soc Trop Med Hyg 78(5): 596-603. Faine, S., B. Adler, et al. (1999). "Leptospira and Leptospirosis. ." Second Edition. MediSci, Melbourne, Australia. . Felzemburgh, R. D., G. S. Ribeiro, et al. (2014). "Prospective study of leptospirosis transmission in an urban slum community: role of poor environment in repeated exposures to the Leptospira agent." PLoS Negl Trop Dis 8(5): e2927. Fialho, R. N., L. Martins, et al. (2009). "Role of human leukocyte antigen, killer-cell immunoglobulin-like receptors, and cytokine gene polymorphisms in leptospirosis." Hum Immunol 70(11): 915-20. Flannery, B., M. M. Pereira, et al. (2001). "Referral pattern of leptospirosis cases during a large urban epidemic of dengue." Am J Trop Med Hyg 65(5): 657-63. Forwell, M. A., P. J. Redding, et al. (1984). "Leptospirosis complicated by fatal intracerebral haemorrhage." Br Med J (Clin Res Ed) 289(6458): 1583. Friedland, J. S. and D. A. Warrell (1991). "The Jarisch-Herxheimer reaction in leptospirosis: possible pathogenesis and review." Rev Infect Dis 13(2): 207-10. Galloway, R. L. and P. N. Levett (2010). "Application and validation of PFGE for serovar identification of Leptospira clinical isolates." PLoS Negl Trop Dis 4(9). Ganoza, C. A., M. A. Matthias, et al. (2006). "Determining risk for severe leptospirosis by molecular analysis of environmental surface waters for pathogenic Leptospira." PLoS Med 3(8): e308. Ganoza, C. A., M. A. Matthias, et al. (2010). "Asymptomatic renal colonization of humans in the peruvian Amazon by Leptospira." PLoS Negl Trop Dis 4(2): e612. Gonsalez, C. R., J. Casseb, et al. (1998). "Use of doxycycline for leptospirosis after high-risk exposure in Sao Paulo, Brazil." Rev Inst Med Trop Sao Paulo 40(1): 59-61. Gouveia, E. L., J. Metcalfe, et al. (2008). "Leptospirosis-associated severe pulmonary hemorrhagic syndrome, Salvador, Brazil." Emerg Infect Dis 14(3): 505-8. Haake, D. A., M. Dundoo, et al. (2002). "Leptospirosis, water sports, and chemoprophylaxis." Clin Infect Dis 34(9): e40-3. HAS (2011). "Diagnostic Biologique de la Leptospirose." Haute Autorité de Santé.(Ce rapport d'évaluation est téléchargeable sur www.has-sante.fr). Herrmann-Storck, C., A. Brioudes, et al. (2005). "Retrospective review of leptospirosis in Guadeloupe, French West Indies 1994-2001." West Indian Med J 54(1): 42-6. Herrmann-Storck, C., M. Saint-Louis, et al. (2010). "Severe leptospirosis in hospitalized patients, Guadeloupe." Emerg Infect Dis 16(2): 331-4. Herrmann, J. L., E. Bellenger, et al. (1992). "Pulsed-field gel electrophoresis of NotI digests of leptospiral DNA: a new rapid method of serovar identification." J Clin Microbiol 30(7): 1696-702. Hotez, P. J., M. E. Bottazzi, et al. (2008). "The neglected tropical diseases of Latin America and the Caribbean: a review of disease burden and distribution and a roadmap for control and elimination." PLoS Negl Trop Dis 2(9): e300. Janaud, L. (2007). "Diagnostic de la leptospirose par PCR en temps réel au centre hospitalier de Fort de France. Thèse pour le diplome d'état de Docteur en médecine. ." Johnson, M. A., H. Smith, et al. (2004). "Environmental exposure and leptospirosis, Peru." Emerg Infect Dis 10(6): 1016-22. Johnson, R. C. and V. G. Harris (1967). "Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures." J Bacteriol 94(1): 27-31.

110

Katz, A. R., V. E. Ansdell, et al. (2001). "Assessment of the clinical presentation and treatment of 353 cases of laboratory-confirmed leptospirosis in Hawaii, 19741998." Clin Infect Dis 33(11): 1834-41. Katz, A. R., V. E. Ansdell, et al. (2002). "Leptospirosis in Hawaii, 1974-1998: epidemiologic analysis of 353 laboratory-confirmed cases." Am J Trop Med Hyg 66(1): 61-70. Katz, A. R., A. E. Buchholz, et al. (2011). "Leptospirosis in Hawaii, USA, 19992008." Emerg Infect Dis 17(2): 221-6. Katz, A. R., P. V. Effler, et al. (2003). "Comparison of serology and isolates for the identification of infecting leptospiral serogroups in Hawaii, 1979-1998." Trop Med Int Health 8(7): 639-42. Katz, A. R., D. M. Sasaki, et al. (1997). "Leptospirosis on Oahu: an outbreak among military personnel associated with recreational exposure." Mil Med 162(2): 101-4. Ko, A. I., M. Galvao Reis, et al. (1999). "Urban epidemic of severe leptospirosis in Brazil. Salvador Leptospirosis Study Group." Lancet 354(9181): 820-5. Ko, A. I., C. Goarant, et al. (2009). "Leptospira: the dawn of the molecular genetics era for an emerging zoonotic pathogen." Nat Rev Microbiol 7(10): 736-47. Kusum, M., N. Boonsarthorn, et al. (2005). "Comparison of leptospiral serovars identification by serology and cultivation in northeastern region, Thailand." J Med Assoc Thai 88(8): 1098-102. LaRocque, R. C., R. F. Breiman, et al. (2005). "Leptospirosis during dengue outbreak, Bangladesh." Emerg Infect Dis 11(5): 766-9. Lau, C. L., L. D. Smythe, et al. (2010). "Climate change, flooding, urbanisation and leptospirosis: fuelling the fire?" Trans R Soc Trop Med Hyg 104(10): 631-8. Lessa, I. and E. Cortes (1981). "Cerebrovascular accident as a complication of leptospirosis." Lancet 2(8255): 1113. Levett, P. and L. Smythe (2006). "International Committee on Systematics of Prokaryotes; Subcommittee on the taxonomy of Leptospiraceae " Int I Syst Evol Microbiol 56: 2019-20. Levett, P. N. (2001). "Leptospirosis." Clin Microbiol Rev 14(2): 296-326. Levett, P. N. (2003). "Usefulness of serologic analysis as a predictor of the infecting serovar in patients with severe leptospirosis." Clin Infect Dis 36(4): 447-52. Lingappa, J., T. Kuffner, et al. (2004). "HLA-DQ6 and ingestion of contaminated water: possible gene-environment interaction in an outbreak of Leptospirosis." Genes Immun 5(3): 197-202. Mailloux, M., R. Lambert, et al. (1982). "Résultats de la vaccination humaine contre la leptospirose ictérohémorragique dans la région parisienne." Bull AcadNatl Med 166: 1151-1160. Mailloux, M., R. Lambert, et al. (1983). "La vaccination humaine contre la leptospirose ictéro-hémorragique." Med Hyg 41: 1025-30. Majed, Z., E. Bellenger, et al. (2005). "Identification of variable-number tandem-repeat loci in Leptospira interrogans sensu stricto." J Clin Microbiol 43(2): 539-45. Marotto, P. C., C. M. Nascimento, et al. (1999). "Acute lung injury in leptospirosis: clinical and laboratory features, outcome, and factors associated with mortality." Clin Infect Dis 29(6): 1561-3. Martin, L., A. Pettit, et al. (1918). "Séro-diagnostic de la spirochaetose ictérohaemorrhagique." Bull Mem Soc Med Hop Paris 42: 672-5. McBride, A. J., D. A. Athanazio, et al. (2005). "Leptospirosis." Curr Opin Infect Dis 18(5): 376-86. McClain, J. B., W. R. Ballou, et al. (1984). "Doxycycline therapy for leptospirosis." Ann Intern Med 100(5): 696-8. 111

McMichael, A. J., R. E. Woodruff, et al. (2006). "Climate change and human health: present and future risks." Lancet 367(9513): 859-69. Merien, F., P. Amouriaux, et al. (1992). "Polymerase chain reaction for detection of Leptospira spp. in clinical samples." J Clin Microbiol 30(9): 2219-24. Merien, F., D. Portnoi, et al. (2005). "A rapid and quantitative method for the detection of Leptospira species in human leptospirosis." FEMS Microbiol Lett 249(1): 139-47. Ministère des Affaires sociales et de la Santé, s. l. a. d. H. C. d. l. s. p. (2013). "Vaccination contre la leptospirose." Calendrier vaccinal et recommandations vaccinales 2013: 17. Monsuez, J. J., R. Kidouche, et al. (1997). "Leptospirosis presenting as haemorrhagic fever in visitor to Africa." Lancet 349(9047): 254-5. Morgan, A. G. and F. Cawich (1980). "Ascending polyneuropathy in leptospirosis--a case study." Ann Trop Med Parasitol 74(5): 567-8. Morgan, J., S. L. Bornstein, et al. (2002). "Outbreak of leptospirosis among triathlon participants and community residents in Springfield, Illinois, 1998." Clin Infect Dis 34(12): 1593-9. Nally, J. E., C. Chantranuwat, et al. (2004). "Alveolar septal deposition of immunoglobulin and complement parallels pulmonary hemorrhage in a guinea pig model of severe pulmonary leptospirosis." Am J Pathol 164(3): 1115-27. Nally, J. E., E. Chow, et al. (2005). "Changes in lipopolysaccharide O antigen distinguish acute versus chronic Leptospira interrogans infections." Infect Immun 73(6): 3251-60. Nardone, A., I. Capek, et al. (2004). "Risk factors for leptospirosis in metropolitan France: results of a national case-control study, 1999-2000." Clin Infect Dis 39(5): 751-3. Nascimento, A. L., A. I. Ko, et al. (2004). "Comparative genomics of two Leptospira interrogans serovars reveals novel insights into physiology and pathogenesis." J Bacteriol 186(7): 2164-72. Network., T. A. R. D. S. (2000). "Ventilation with lower tidal volumes as compared with traditional tidal volumes for acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome. The Acute Respiratory Distress Syndrome Network." N Engl J Med 342(18): 1301-8. O'Neil, K. M., L. S. Rickman, et al. (1991). "Pulmonary manifestations of leptospirosis." Rev Infect Dis 13(4): 705-9. Paganin, F., A. Bourdin, et al. (2009). "[Pulmonary manifestations of leptospirosis]." Rev Mal Respir 26(9): 971-9. Paganin, F., A. Bourdin, et al. (2007). "Leptospirosis in Reunion Island (Indian Ocean): analysis of factors associated with severity in 147 confirmed cases." Intensive Care Med 33(11): 1959-66. Palaniappan, R. U., Y. F. Chang, et al. (2002). "Cloning and molecular characterization of an immunogenic LigA protein of Leptospira interrogans." Infect Immun 70(11): 5924-30. Panaphut, T., S. Domrongkitchaiporn, et al. (2002). "Prognostic factors of death in leptospirosis: a prospective cohort study in Khon Kaen, Thailand." Int J Infect Dis 6(1): 52-9. Panaphut, T., S. Domrongkitchaiporn, et al. (2003). "Ceftriaxone compared with sodium penicillin g for treatment of severe leptospirosis." Clin Infect Dis 36(12): 1507-13. Pappas, G., P. Papadimitriou, et al. (2008). "The globalization of leptospirosis: worldwide incidence trends." Int J Infect Dis 12(4): 351-7. Park, S. K., S. H. Lee, et al. (1989). "Leptospirosis in Chonbuk Province of Korea in 1987: a study of 93 patients." Am J Trop Med Hyg 41(3): 345-51. Perrocheau, A. and P. Perolat (1997). "Epidemiology of leptospirosis in New Caledonia (South Pacific): a one-year survey." Eur J Epidemiol 13(2): 161-7.

112

Phraisuwan, P., E. A. Whitney, et al. (2002). "Leptospirosis: skin wounds and control strategies, Thailand, 1999." Emerg Infect Dis 8(12): 1455-9. Picardeau, M. (2013). "Diagnosis and epidemiology of leptospirosis." Med Mal Infect 43(1): 1-9. Picardeau, M. and P. Bourhy (2012). "Centre National de Référence de la Leptospirose. Rapport Annuel d'Activité." (Disponible à partir de l'URL: http://www.pasteur.fr/ip/easysite/pasteur/fr/sante/centres-nationaux-dereference-et-centres-collaborateurs-de-l-oms/cnr-et-ccoms/cnr-ccoms-desleptospires/actualites-rapports). Picardeau, M. and P. Bourhy (2013). "Centre National de Référence de la Leptospirose. Rapport Annuel d'Activité." (Disponible à partir de l'URL: http://www.pasteur.fr/ip/easysite/pasteur/fr/sante/centres-nationaux-dereference-et-centres-collaborateurs-de-l-oms/cnr-et-ccoms/cnr-ccoms-desleptospires/actualites-rapports). Picardeau, M., D. M. Bulach, et al. (2008). "Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis." PLoS ONE 3(2): e1607. Picardeau, M., M. Cornet, et al. (2008). "Impact du changement de nomenclature médicale sur le diag-nostic et la surveillance de la leptospirose en France." Bull Epidemiol Hebd 37: 329-31. Postic, D., F. Mérien, et al. (2000). "Diagnostic biologique Leptospirose-Borréliose de Lyme. paris: Institut Pasteur.". Rajiv, C., R. J. Manjuran, et al. (1996). "Cardiovascular involvement in leptospirosis." Indian Heart J 48(6): 691-4. Ramachandran, S. and M. V. Perera (1977). "Cardiac and pulmonary involvement in leptospirosis." Trans R Soc Trop Med Hyg 71(1): 56-9. Rathinam, S. R. (2005). "Ocular manifestations of leptospirosis." J Postgrad Med 51(3): 18994. Rathinam, S. R., S. Rathnam, et al. (1997). "Uveitis associated with an epidemic outbreak of leptospirosis." Am J Ophthalmol 124(1): 71-9. Rawlins, J., A. Portanova, et al. (2014). "Molecular detection of leptospiral DNA in environmental water on St. Kitts." Int J Environ Res Public Health 11(8): 7953-60. Reis, R. B., G. S. Ribeiro, et al. (2008). "Impact of environment and social gradient on Leptospira infection in urban slums." PLoS Negl Trop Dis 2(4): e228. Ren, S. X., G. Fu, et al. (2003). "Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing." Nature 422(6934): 888-93. Ricaldi, J. N., M. A. Swancutt, et al. (2013). "Current trends in translational research in leptospirosis." Curr Opin Infect Dis 26(5): 399-403. Riley, L. W., A. I. Ko, et al. (2007). "Slum health: diseases of neglected populations." BMC Int Health Hum Rights 7: 2. Ristow, P., P. Bourhy, et al. (2008). "Biofilm formation by saprophytic and pathogenic leptospires." Microbiology 154(Pt 5): 1309-17. Rodrigo, C., N. Lakshitha de Silva, et al. (2014). "High dose corticosteroids in severe leptospirosis: a systematic review." Trans R Soc Trop Med Hyg. Rojas, P., A. M. Monahan, et al. (2010). "Detection and quantification of leptospires in urine of dogs: a maintenance host for the zoonotic disease leptospirosis." Eur J Clin Microbiol Infect Dis 29(10): 1305-9. Saint Girons, I., D. Margarita, et al. (1990). "First isolation of bacteriophages for a spirochaete: potential genetic tools for Leptospira." Res Microbiol 141(9): 1131-8.

113

Salaun, L., F. Merien, et al. (2006). "Application of multilocus variable-number tandemrepeat analysis for molecular typing of the agent of leptospirosis." J Clin Microbiol 44(11): 3954-62. Salkade, H. P., S. Divate, et al. (2005). "A study of sutopsy findings in 62 cases of leptospirosis in a metropolitan city in India." J Postgrad Med 51(3): 169-73. Sarkar, U., S. F. Nascimento, et al. (2002). "Population-based case-control investigation of risk factors for leptospirosis during an urban epidemic." Am J Trop Med Hyg 66(5): 605-10. Segura, E. R., C. A. Ganoza, et al. (2005). "Clinical spectrum of pulmonary involvement in leptospirosis in a region of endemicity, with quantification of leptospiral burden." Clin Infect Dis 40(3): 343-51. Seguro, A. C., A. V. Lomar, et al. (1990). "Acute renal failure of leptospirosis: nonoliguric and hypokalemic forms." Nephron 55(2): 146-51. Sehgal, S. C., A. P. Sugunan, et al. (2000). "Randomized controlled trial of doxycycline prophylaxis against leptospirosis in an endemic area." Int J Antimicrob Agents 13(4): 249-55. Sejvar, J., E. Bancroft, et al. (2003). "Leptospirosis in "Eco-Challenge" athletes, Malaysian Borneo, 2000." Emerg Infect Dis 9(6): 702-7. Smythe, L. D., V. Wuthiekanun, et al. (2009). "The microscopic agglutination test (MAT) is an unreliable predictor of infecting Leptospira serovar in Thailand." Am J Trop Med Hyg 81(4): 695-7. Spichler, A. S., P. J. Vilaca, et al. (2008). "Predictors of lethality in severe leptospirosis in urban Brazil." Am J Trop Med Hyg 79(6): 911-4. Stern, E. J., R. Galloway, et al. (2010). "Outbreak of Leptospirosis among Adventure Race Participants in Florida, 2005." Clin Infect Dis 50(6): 843-9. Stoddard, R. A., J. E. Gee, et al. (2009). "Detection of pathogenic Leptospira spp. through TaqMan polymerase chain reaction targeting the LipL32 gene." Diagn Microbiol Infect Dis 64(3): 247-55. Storck, C. H., D. Postic, et al. (2008). "Changes in epidemiology of leptospirosis in 2003-2004, a two El Nino Southern Oscillation period, Guadeloupe archipelago, French West Indies." Epidemiol Infect 136(10): 1407-15. Suputtamongkol, Y., K. Niwattayakul, et al. (2004). "An open, randomized, controlled trial of penicillin, doxycycline, and cefotaxime for patients with severe leptospirosis." Clin Infect Dis 39(10): 1417-24. Takafuji, E. T., J. W. Kirkpatrick, et al. (1984). "An efficacy trial of doxycycline chemoprophylaxis against leptospirosis." N Engl J Med 310(8): 497-500. Tantitanawat, S. and S. Tanjatham (2003). "Prognostic factors associated with severe leptospirosis." J Med Assoc Thai 86(10): 925-31. Trevejo, R. T., J. G. Rigau-Perez, et al. (1998). "Epidemic leptospirosis associated with pulmonary hemorrhage-Nicaragua, 1995." J Infect Dis 178(5): 1457-63. Trombert-Paolantoni, S., P. Thomas, et al. (2009). "Leptospirosis screening: performance of the Serion Elisa Classic Leptospira IgM KIT." Pathol Biol (Paris) 58(1): 95-9. Trueba, G., S. Zapata, et al. (2004). "Cell aggregation: a mechanism of pathogenic Leptospira to survive in fresh water." Int Microbiol 7(1): 35-40. Tubiana, S., M. Mikulski, et al. (2013). "Risk factors and predictors of severe leptospirosis in New Caledonia." PLoS Negl Trop Dis 7(1): e1991. Vein, J., A. Perrin, et al. (2012). "Adaptation of a real-time PCR method for the detection and quantification of pathogenic leptospires in environmental water." Can J Microbiol 58(7): 828-35.

114

Vinetz, J. M. (2003). "A mountain out of a molehill: do we treat acute leptospirosis, and if so, with what?" Clin Infect Dis 36(12): 1514-5. Watt, G., L. P. Padre, et al. (1988). "Placebo-controlled trial of intravenous penicillin for severe and late leptospirosis." Lancet 1(8583): 433-5. Weinberger, D., N. Baroux, et al. (2014). "El Nino Southern Oscillation and leptospirosis outbreaks in New Caledonia." PLoS Negl Trop Dis 8(4): e2798. WHO (1999). "Leptospirosis worldwide, 1999." Wkly Epidemiol Rec 74(29): 237-42. WHO (2003). "Human leptospirosis : guidance for diagnosis, surveillance and control.". WHO (2011). "Leptospirosis: an emerging public health problem." Wkly Epidemiol Rec 86(6): 45-50. Yersin, C., P. Bovet, et al. (2000). "Pulmonary haemorrhage as a predominant cause of death in leptospirosis in Seychelles." Trans R Soc Trop Med Hyg 94(1): 71-6. Yersin, C., P. Bovet, et al. (1998). "Human leptospirosis in the Seychelles (Indian Ocean): a population-based study." Am J Trop Med Hyg 59(6): 933-40. Zaki, S. R. and W. J. Shieh (1996). "Leptospirosis associated with outbreak of acute febrile illness and pulmonary haemorrhage, Nicaragua, 1995. The Epidemic Working Group at Ministry of Health in Nicaragua." Lancet 347(9000): 535-6.

115

8. ANNEXES 8.1 Résumé du Protocole de Recherche Clinique LEPTO

116

117

118

119

120

121

8.2 Illustration des sites de trail et de canyoning

Traversées de rivières lors de la course du 16 mai 2009

Site de Canyoning sur la rivière Absalon

122

8.3 Fiches d’informations destinées aux pratiquants des sports à risque de leptospirose (recto/vero)

123

124

8. 4 Résumé du Protocole de Recherche Clinique Ciné LEPTO

125

126

127

128